尖顶羊肚菌人工栽培

赵丹丹1,李凌飞2,赵永昌3,钱金良1,田果廷3*
(1 云南省农业科学院农业经济与信息研究所,云南昆明650205;2 云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明650201;3 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,云南昆明650223)

食用菌学报2010.17(1)

　　摘要:采用3种母种培养基和5种原种培养基对分离到的一株尖顶羊肚菌(Morchella conica)进行人工栽培,并探讨了温度、光照和覆土对羊肚菌菌丝生长和出菇的影响。结果表明,母种培养基M1与原种培养基Y1最有利于菌丝生长和菌核形成。Y1培养基有利于羊肚菌子实体的形成,且在菌丝满袋后不覆土、强光刺激48h、室温(13～23℃)处理下实现出菇。

　　关键词:羊肚菌;培养基;人工栽培

　　羊肚菌(Morchella)是一种著名食(药)用真菌,其子实体富含蛋白质、多糖、核酸、多种微量元素以及维生素,有增强免疫功能、抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、抗诱变、降血脂等多种功效,深受人们喜爱且在国际市场十分走俏[1-4]。然而由于羊肚菌的生长对气候、土壤等环境条件的要求,其分布范围相对狭窄,自然产量低,远不能满足人们的需要。多年来,羊肚菌的人工驯化栽培一直是菌物界的研究热点之一,虽然国内外均有成功栽培羊肚菌的报道,但迄今为止尚未见商品化栽培的羊肚菌应市[5],且国内羊肚菌栽培存在大田栽培出菇不稳定和室内栽培不出菇的尴尬状况[6]。我国西南地区是羊肚菌资源分布最广泛和种类最丰富的地区之一[7],笔者分离了采自该地区的一株尖顶羊肚菌,并进行培养条件和栽培技术研究,以期为羊肚菌的人工栽培和开发利用提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 供试菌株

　　羊肚菌子实体样品采自云南省玉龙纳西族自治县鲁甸乡,对其进行ITS(Internal Transcribed Spacers)序列比对,结合形态解剖学分类,鉴定为尖顶羊肚菌(Morchella conica)[8,9]。

　　1.2 培养基

　　1.2.1 孢子分离培养基

　　F1(/L):杨树枝、杨树根浸出液200 mL(滇杨Populus yunnanensis枝条70g,滇杨根30g,水500mL,煮沸5min,冷却过滤),葡萄糖10g,蔗糖5g,麦芽糖1g,牛肉膏1g,酵母膏1g,KH₂PO₄ 0.1g,(NH₄)₃PO₄ 0.5g,MgSO₄0.05g,烟酸2μg,琼脂20g。

　　1.2.2 母种培养基

　　M1(/L):麦粒200g(按郁建强等的方法处理)[10],葡萄糖10g,维生素B₁ 0.1g,琼脂15g。
　　M2(/L):马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g。
　　M3(/L):葡萄糖10g,蔗糖5g,麦芽糖1g,牛肉膏4g,酵母膏4g,KH₂PO₄ 1g,(NH₄)₃PO₄0.5g,MgSO₄ 0.5g,维生素B₁ 0.1g,烟酸2μg,琼脂15g。

　　1.2.3 原种培养基

　　Y1:麦粒100%(按魏银初等的方法处理)[11],含水量55%。
　　Y2:棉子壳70%,杨树木屑25%,麦麸4%,Ca(OH)₂1%,含水量60%。
　　Y3:杨树木屑70%,棉子壳25%,麦麸4%,Ca(OH)₂1%,含水量60%。
　　Y4:草糠70%,棉子壳25%,麦麸4%,Ca(OH)₂1%,含水量60%。
　　Y5:棉子壳95%,麦麸4%,Ca(OH)₂1%,含水量60%。

　　1.3 孢子收集及悬液制备

　　选取8至9成熟生长健壮的羊肚菌子实体,按照赵琪等的方法收集孢子[12],参照陈士瑜的方法制备100～300个/mL的孢子悬浮液[13]。

　　1.4 孢子分离及菌丝培养

　　取0.1mL孢子悬浮液均匀涂布于直径为9cm的F1平板上,25℃培养5d,计算萌发率,分别挑取5个单菌落尖端的菌丝至新的F1平板上培养,按照沈萍等的方法制作水封片[14],显微镜下观察羊肚菌菌丝形态特征,在菌丝生长最旺盛的平板上挑取尖端菌丝体移接到F1斜面,于25℃培养获得羊肚菌试管种。

　　1.5 母种培养

　　将羊肚菌试管种转接于F1平板中,25℃培养4d制成平板菌种,取直径为3mm的菌块分别接到直径为9cm的M1、M2和M3平板中央,25℃培养,每隔12h观察1次,观测菌丝生长速度,长势,菌核形成时间及大小[13]。每处理5个重复。

　　1.6 原种培养和出菇

　　在M1制成的平板母种上取直径为3mm的菌块,分别接种在Y1、Y2、Y3、Y4、Y5原种培养料内(采用33cm×15cm×0.005cm的聚丙烯折角袋装料,每袋装料量折合干重350g,0.14MPa蒸汽灭菌150min),每袋接种4个菌块,室温(16～23℃)培养。菌袋定期划线观测菌丝长速,长势、颜色、自溶情况、气生菌丝状况、菌丝满袋和菌核形成时间和菌核大小、数量[15]。

　　腐殖土在0.10MPa下灭菌10min和30min,冷却后分别覆盖于已长满菌丝的菌袋表面(5cm厚),以不覆土的菌袋为对照,分别设5℃、16℃、16/5℃每24h交替处理以及室温(13～23℃)4个温度处理,3个光照处理:A.强光(约10000 lux)刺激48h后返回自然光(约500～2000 lux);B.自然光培养;C.弱光(约200lux)培养。观察菌核颜色从白色或浅黄色逐渐转为褐色为止,无菌核产生的菌袋也同时结束观察。

　　2 结果与分析

　　2.1分离培养基对孢子萌发的影响

　　羊肚菌孢子在培养的第3天萌发,萌发率为100%。

　　2.2 母种培养基对菌丝生长的影响

　　羊肚菌菌丝在3种母种培养基上都能生长,显微镜下观察到菌丝直径约10μm,菌丝横膈和内含物多。菌丝在初期生长旺盛,后期生长缓慢,气生菌丝多,随后出现菌核,菌核由小变大,颜色由浅黄色变为褐色,聚集成片。表1表明,M1平板上的菌丝长速、菌核形成时间与M2差异不大,但M1上的菌核数量较多。M3平板上的菌丝生长较慢,菌核形成较晚且少。3种平板上的菌丝都在接种后约29d开始自溶。

表1不同母种培养基羊肚菌菌丝生长和菌核形成情况

母种培养基 菌丝长速(mm/d) 菌核形成时间(d) 菌核数量
　　M1　　　9.8±0.07　　　11±0.7 　　　　很多
　　M2　　　9.5±0.10　　　11±0.8　　　　　多
　　M3　　　8.9±0.11　　　14±0.8　　　　　少
表中数据为连续观察30d的结果

　　2.3 原种培养基对菌丝生长和温度、覆土、光照对出菇的影响

　　5种原种培养基中菌丝的生长速度差异不大,接种至满袋时间为24d,生长后期气生菌丝较多、菌丝呈深褐色,但菌核形成时间、数量、大小有差异(表2)。纯麦粒培养基(Y1)中菌核多、大且形成时间早,但自溶时间也较早,而其它培养基虽然自溶时间较晚,但菌核形成时间晚、数量少且小。

　　每种原种培养基菌袋分别做覆土和不覆土处理,同时进行不同温度和光照处理,结果发现,菌核颜色都从白色或浅黄色逐渐转为褐色,随后从菌核上重新生长出白色菌丝。5种原种培养基菌袋中菌丝满袋时间都为24d,覆土后菌丝长满土层的时间也都为5d。但只发现Y1原种菌袋在不覆土、室温、强光刺激下出现羊肚菌子实体(封三图1),菌丝满袋至原基形成约65d,原基形成至发育成符合尖顶羊肚菌生物学特性形态结构的子囊果约需10d,且子实体生长较差:子囊果小,长度2.1～3.9cm,肉质薄,鲜重1.56～2.25g,子囊果鲜重还不到野生尖顶羊肚菌平均鲜重的十分之一;色泽一般为浅肉色至浅淡红紫色,顶部色泽较浅;菌盖呈不规则圆锥形,表层直肋发达,横脉较不明显,子囊果下部常具有星芒状附着物;菌柄短,中空,有明显的芒状凸起。此时子实体尚未完全成熟,2d后即开始萎缩,其它处理均无出菇现象。为证实出菇羊肚菌的真实性,我们对出菇的羊肚菌子实体进行组织分离,在上述出菇条件下培养,菌丝生长旺盛,且再次出现结实,但子实体生长依然较差。

表2不同原种培养基羊肚菌菌丝生长和菌核形成情况

原种培养基 菌丝长速(mm/d) 菌核形成时间(d) 菌核数量和大小 开始自溶时间(d)
　Y1 　　　　5.1±0.07　　　14±0.55　　　 + + + + , L 　　29
　Y2　　　　 4.5±0.13　　　17±0.55 　　　+ + , M　　　　 80
　Y3　　　　 4.9±0.11　　　17±0.63 　　　+ , S 　　　　　79
　Y4 　　　　4.5±0.07　　　19±0.66 　　　+ , S 　　　　　78
　Y5 　　　　4.6±0.09　　　18±0.40 　　　+ , S 　　　　　79
“+ + + +”很多,“+ +”较多,“+”少;“L”菌核直径≥10mm,“M”10mm>菌核直径≥3mm,“S”菌核直径<3mm(连续观察30d,菌核数量和大小取第25和30天测量所得的平均值)

　　3 讨论

　　母种、原种培养基对菌丝的生长速度、菌核形成时间与数量、大小有影响。M1和Y1分别为最佳母种和原种培养基,说明增加培养基的营养成分不一定促进菌丝生长,且促进羊肚菌菌丝生长的营养成分也不一定促进菌核的形成。以往的研究中尖顶羊肚菌人工栽培时需覆土,子囊果原基分化时需散射光(光强约600～1000lux)刺激,光照过强不利于尖顶羊肚菌子囊果的分化[5,16,17],而本试验采用的菌种在纯麦粒基质、不覆土、室温、强光刺激下有出菇现象,这样纯培养条件下获得的子实体尽管尚未完全分化,但为羊肚菌的人工栽培提出了新的途径。

　　参考文献

　　[1]李华,包海鹰,李玉.羊肚菌研究进展[J].菌物研究,2004,2(4):53-60.
　　[2] DU NCAN CJ, PUGH N, PASCO DS, et al .Isolation of a galactomannan that enhances macrophage activation from the edible fungus Morchella esculenta[J].J Agric Food Chem, 2002,50(20):5683-5685.
　　[3] NITH A B, MEERA CR, JANARDHANAN KK. Antiinflammatory and antitumour activities of cultured mycelium of morel mushroom, Morchella esculenta[J].Curr Sci,2007,92(2):235-239.
　　[4] TSAI SY, WENG CC, HU ANG SJ, et al . Nonrr volatile taste components of Grifola frondosa,Morchella esculenta and Termitomyces albuminosus mycelia [J].Food Sci Technol,2006,39:1066-1071.
　　[5]陈建军,伍晓洪,刘振乾.羊肚菌生态位及其培养技术研究[J].安徽农业科学,2009,37(2):638-639.
　　[6]朱斗锡.羊肚菌人工栽培研究进展[J].中国食用菌,2008,27(4):3-5.
　　[7]赵永昌,柴红梅,李树红.云南羊肚菌居群多样性研究[J].西南农业学报,2008,21(2):444-447.
　　[8]沈洪,陈明杰,赵永昌.云南羊肚菌rDNA的ITS序列与亲缘关系分析[J].食用菌学报,2007,14(2):15-18.
　　[9]兰进,曹文芩,徐锦堂.中国羊肚菌属真菌资源[J].资源科学,1999,21(2):56-61.
　　[10]郁建强殷戎一.食用菌麦粒母种的制作[J].长江蔬菜,1993,(6):35.
　　[11]魏银初,崔苗青,李九英.制麦粒菌种应把好五关[J].农家参谋,2005,(4):19.
　　[12]赵琪,徐中志,袁理春.一种羊肚菌孢子快速收集方法[P].中国专利:101IOO647A,2008-1-9.
　　[13]陈士瑜.菇菌生产技术全书[M].北京:中国农业出版社,1999.
　　[14]沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验[M].北京:高等教育出版社,1999.
　　[15]赵永昌,吴毅歆,严世武.羊肚菌发生区气候土壤生态环境研究[J].中国食用菌,1997,17(3):24-26.
　　[16]李树森,陈文强,邓百万,等.秦巴山区羊肚菌栽培试验初报[J].食用菌,2008(2):39-40.
　　[17]赵琪,徐中志,程远辉,等.尖顶羊肚菌仿生栽培技术[J].西南农业学报,2009,22(6):1690-1693.

　　作者简介:赵丹丹(1979- ),女,2006年毕业于云南大学生物科学院,硕士,助理研究员,主要从事真菌资源利用及育种研究。
*本文通讯作者 Email:tiangt@yahoo.com.cn