利用分子标记辅助育种技术选育低温高产草菇菌株
赵妍1*，颜素雅1*，林锋1，余昌霞1，蒋俊2，陈明杰1**，宋晓霞1**
（1.国家食用菌工程技术研究中心,上海市农业科学院食用菌研究所；2.丽水市农业科学研究院食药用菌研究所）
分子植物育种 2017年第8期
草菇是一种喜温、喜湿，自然条件下生长在稻草上的腐生型真菌，故得名。草菇在分类学上属于真菌界(Fungi)、担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agaricomycetes)、伞菌目(Agaricales)、光柄菇科(Pluteaceae)、小包脚菇属(Volvariella)(张树庭,1975)。在中国，草菇已经有三百多年的栽培历史，种植区域主要分布在广东、广西、福建、台湾、海南等地区(Chang,1977)。与其它人工栽培的食用菌相比，草菇的生物转化率极低，一般仅有20%左右，草菇菌丝生长的最适温度范围为32～35℃，当温度低于15℃或高于42℃时，菌丝生长缓慢，温度低于10℃时菌丝停止生长。子实体分化发育的最适温度范围为27～31℃，23℃以下难以形成子实体(邓优锦等,2011)。草菇对高温的要求使得在自然条件下草菇的生产局限在中国少数几个省份，再加上采收时气温高，又不能低温贮藏，严重制约了草菇的生产与流通。多年来，许多学者致力于草菇保鲜技术的研究，孙育红等(2010)发明的气调包装盒，可使草菇在12℃下保存96h以上，最长可达120h；叶蕙等(2000)用0.8kGy的60Co-γ处理可使草菇贮藏期延长至6d。但由于这些方法成本较高，加上各地物流水平的差异，使得草菇的流通出现种种局限。因此要想从根本上解决上述问题，需要培育出适合当地生产的耐低温且高产的草菇新品种。
食用菌的育种方法主要有自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种等(陈恒雷和曾宪贤2005;林锋等,2014)。其中杂交育种由于其操作简单，预见性强而被广泛使用，但由于草菇属于同宗结合的真菌，其菌丝多核且没有锁状联合(ChangandYau,1971)，杂交种的鉴定缺乏切实可行的方法(谢宝贵等,2001)，致使草菇杂交选育难以进行。近年来，分子标记技术在草菇育种领域逐渐被应用，如陈剑等(2011)利用RAPD技术对草菇杂交后代及其亲本进行鉴定，成功鉴定出杂交产物；傅俊生等(2010a)利用SCAR标记对杂种进行鉴定以及杂种后代单孢分离产物分析，这些分子标记技术的应用解决了草菇杂交育种过程中因菌丝细胞多核且无锁状联合而缺乏有效鉴定杂交后代的难题，使得杂交育种在草菇育种中的作用越来越重要。
本研究首先借助RAPD分子标记技术对11个草菇菌株进行了遗传差异分析，发现VH3和泰国No.1菌株遗传距离较大，亲缘关系较远。因此我们将低温菌株VH3和与其亲缘关系较远的泰国No.1菌株作为杂交亲本，分离得到它们的单孢子，分别命名为V1～V10和T1～T10，进行两两杂交；通过0℃低温处理筛选获得耐低温的杂交子，再利用交配型基因分子标记扩增来鉴定杂交子的真实性，最后通过低温栽培出菇试验对耐低温杂交子进行了出菇农艺性状的考察，初步获得了耐低温性良好且生物转化率较高的草菇杂交菌株。
1 结果与分析
1.1 RAPD分析
利用8条引物对11个草菇样本进行扩增，8条引物均能扩增出稳定性强、可重复性高且多态性丰富的条带，每个引物扩增出的DNA条带数从5到11不等，8条引物共扩增出54个RAPD位点，其中多态性位点有37个，多态性频率为68.5%，说明草菇菌株间具有丰富的遗传多样性。
不同草菇菌株间的遗传距离从0.0615到0.4680之间，其中菌株A8与3560遗传距离最近，Vn-1和泰国No.1遗传距离最远，本试验中亲本菌株VH3和泰国No.1的遗传距离为0.3180。使用NTSYSpc软件对11个草菇菌株进行聚类分析，由聚类图可知，在遗传相似系数为0.65时，11个菌株被分成2大类，其中泰国No.1单独聚为一类，其它10个草菇菌株聚为一类；在遗传相似系数为0.722时，11个菌株又被分为3大类：泰国No.1单独聚为一类，Vn-1、VH3、大菇托、V23、WG聚为一类，0229、Vn-3、3560、A8、托31聚为一类。当遗传相似系数为0.91时，11个菌株都能够被分开。作为亲本菌株的VH3和泰国No.1在遗传相似系数为0.65时被分开，说明两者亲缘关系较远。
1.2 单孢菌株的交配型鉴定
对10个VH3单孢进行A1、A2交配型基因的扩增，结果显示V1、V3、V4、V6只有A1条带，V2、V5、V7～V10只有A2条带。对10个泰国No.1单孢进行A3、A4交配型基因的扩增，结果显示T5只有A4条带，其余9株只有A3条带。
1.3 耐低温可能杂交菌株的筛选
对300株可能的草菇杂交子进行低温筛选，与亲本比较恢复生长速度的差异，发现有112株恢复速度快于亲本，41株恢复速度与亲本相当，另有147株恢复长势较差或根本无法恢复生长。CK为对照菌株VH3，A、B、C分别代表恢复生长优、良、差的菌株。
1.4 杂交菌株真实性的鉴定
当菌株同时具有两亲本特异性交配型基因时，才能判断该杂交子的真实性。将耐低温的112株可能杂交子进行PCR扩增后，共得到77株真实杂交子。菌株1～10号为VH3的A1交配型和泰国No.1的A3交配型杂交后得到的杂交子的鉴定结果，1～10号都能扩增出两亲本对应的特异性交配型基因分子标记，表明这10个菌株都是真实的杂交子。
1.5 耐低温杂交菌株出菇情况
出菇的14株杂交子中有10株在生物转化率上具有超亲优势，其中V6T3-1、V10T4-3、V9T3-1、V4T9-2的平均生物转化率大于20%，远高于两亲本。杂交子的原基出现时间和采收时间各不相同，其中V6T3-1原基出现时间平均为6d，远短于两亲本，超亲优势明显。综合来看，V6T3-1不仅在现原基及采收时间上相对于亲本有明显优势，而且生物转化率达到28.26%，是具有潜在应用价值的优良菌株。将V6T3-1子实体提取全基因组DNA，再次利用交配型基因分子标记进行杂合子真实性鉴定，结果证明其为真实的杂交子。
2 讨论
本试验采用RAPD方法对11个草菇菌株进行遗传差异分析，其中泰国No.1与其它的10个菌株遗传距离较远，平均遗传相似系数为0.678，余志晟等(2005)利用RFLP和RAPD方法对国内12个草菇菌株进行分析，发现菌株间的平均遗传相似系数为0.707，韦仕岩等(2013)对17个草菇菌株进行ISSR遗传差异分析，所得到的相似度平均值为0.73，均高于本试验中的数值，说明泰国No.1作为外来菌株在遗传背景上与其它10株国内菌株遗传距离要远。食用菌育种的方法主要有杂交育种、原生质体融合育种、诱变育种、基因工程育种等，杂交育种因其操作简单，可预见性强而被广泛使用。在草菇全基因组测序的基础上，本研究应用新开发的特异性引物A1F/A1R、A2F/A2R对VH3的单孢进行鉴定，运用特异性引物A3F/A3R、A4F/A4R对泰国No.1的单孢进行鉴定，成功鉴定出草菇单孢的交配型类型。单孢杂交配对后，按照A1A3、A1A4、A2A3、A2A4进行鉴定。为了减少杂交子栽培出菇的工作量，先利用低温处理进行初步筛选，运用陈明杰等(2013)“快速筛选耐低温草菇菌种的方法”，本试验中300株可能的草菇杂交子经过低温筛选剩余112株可能的耐低温杂交子，大大减少了后续的工作量。将筛选出的112株可能的杂交子进行交配型基因鉴定后得到77株真正的杂交子，比例达到68.75%。由此可以看出，在出菇试验之前进行耐低温菌株的筛选和杂交子真实性的鉴定，减少了出菇的工作量和能源消耗，大幅度提高了草菇新品种选育的效率。
本研究的出发菌株VH3是一个相对耐低温的草菇菌株，选取与其亲缘关系较远的泰国No.1菌株与之杂交，以期获得低温高产的草菇新菌株。出菇试验结果显示，V6T3-1、V10T4-32个菌株原基出现时间、采收时间均早于两亲本，生物转化率分别为28.26%和22.30%，均高于两亲本。其中V6T3-1不仅采收时间短于亲本，且单筐产量高、菇型好，可在草菇主产区进行小范围试种，验证其产量和农艺性状的稳定性。
3 材料与方法
3.1 试验材料
草菇菌株VH3、泰国No.1、Vn-1、0229、大菇托、V23、3560、A8、WG、Vn-3和托31，由上海市农业科学院食用菌研究所提供。VS-15000CFNⅡ高速冷冻离心机、手动移液器购自德国Eppendorf股份公司；HWS12型电热恒温水浴锅购自上海一恒科学仪器有限公司；ABI9700型PCR扩增仪购自AppliedBiosystems公司；JY600+型电泳仪购自Bio-Rad公司；EC3ImagingSystem凝胶成像系统购自SYNGENE公司。琼脂粉购自基因科技(上海)有限公司；TaKaRaExTaqKit购自宝生物工程(大连)有限公司；D2000DNALadder购自天根生化科技(北京)有限公司。
PDA培养基、PDY培养基为常用培养基。栽培培养基：棉籽壳95%，生石灰5%，相对湿度65%。
3.2 遗传多样性分析
用改进的CTAB法(张红等,2006)提取草菇菌株VH3、泰国No.1、Vn-1、0229、大菇托、V23、3560、A8、WG、Vn-3、托31的全基因组DNA。从35个随机引物中挑选了8个扩增效果及稳定性好的引物对11个草菇菌株进行扩增。PCR扩增程序为：94℃3min；94℃1min，38℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min。RAPD-PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶成像系统照相。使用NTSYSpc软件对数据进行处理，构建遗传相似系数聚类图谱。
3.3 亲本单孢菌株的获取
用孢子收集器收集VH3、泰国No.1的孢子，采用平板稀释涂布法分离单孢菌株，然后将收集的单孢菌株接到PDA斜面上，于15℃保藏备用。
3.4 菌株的活化与扩大培养
将保藏的VH3和泰国No.1的单孢菌株转接到新的PDA斜面中，放置于32℃培养箱中培养3～5d，然后挑取新长出的菌丝转接到新的斜面上，如此重复2～3次。
3.5 单孢菌株的交配型鉴定
将活化后的菌株接入PDY培养基，摇瓶培养2～3d后收集菌丝，冷冻干燥后用改进的CTAB法提取草菇单孢菌株的全基因组DNA。根据草菇交配型A位点的特异性分子标记来设计引物，进行PCR扩增，其中VH3单孢交配型定为A1、A2，泰国No.1单孢交配型定为A3、A4。
3.6 单孢杂交
将已经鉴定交配型的VH3和泰国No.1单孢菌株各10株，两两接到PDA平板上，相距1cm，放到32℃培养箱中恒温培养，待两个菌落连接后，分别从两个菌落连接处和两侧挑取菌块，100种配对组合共有300个可能的杂交子，转接到PDA斜面中，在32℃下培养。为避免因挑取的菌块是由两种单孢菌丝扭结在一起而对后续的鉴定产生影响，挑取菌丝尖端部分进行分离纯化(傅俊生等,2010b)。
3.7 耐低温杂交菌株的筛选
挑取菌块正面朝上接到PDA平板培养基中，放入32℃恒温培养箱培养1～2d，待菌丝长出后沿菌丝生长外缘划线，然后放入0℃处理10h。将低温处理过的平板放回32℃恢复生长3d，观察并记录菌丝恢复生长情况，同时用亲本中耐低温的VH3菌株作为对照，恢复生长速度比VH3快的菌株视为耐低温菌株。
3.8 杂交菌株的鉴定
筛选出的耐低温菌株可能是VH3或泰国No.1菌株的单孢菌株，而不是真正的杂交子，故还需要进一步的分子验证。对获得的可能杂交菌株按照交配型A1A3、A1A4、A2A3、A2A4进行PCR扩增，杂交成功的菌株能同时扩增出具有双亲的两条条带，而未杂交成功的单孢菌株只能扩增出一条条带，即可筛选出真正的杂合子。
3.9 杂交子的低温出菇
选取14株菌丝生长旺盛的杂交子，连同两个亲本同时进行28℃低温出菇试验，每个菌株设置3个平行，按照常规管理方法进行出菇试验，以期筛选出低温高产的草菇杂交新菌株。
