食用菌的菌种选育基础知识连载

第五节 诱变育种

　　本连载其它相关文章：第一节 食用菌的遗传与变异　第二节 食用菌的生活史和繁殖方式　第三节　人工选择育种　第四节　杂交育种

　　诱变育种是指人们有意识地利用物理、化学或生物诱变剂处理生物细胞群体，促使细胞遗传物质发生改变，进而从变异群体中筛选优良品种的过程。遗传物质的改变叫突变。接触诱变剂而发生的突变为诱发突变，没有接触诱变剂而发生的突变为自发突变，自发突变和诱发突变本质上没有区别，只是诱变剂提高了突变频率。因此诱变育种与自然选育相比较，由于引进了诱变剂处理，而使菌种发生突变的频率和变异的幅度得到了提高，从而使筛选获得具有优良特性变异菌株的机率得到了提高。

　　一、诱变剂和诱变机理

　　能够使DNA分子结构发生改变，提高生物体突变频率的物质称为诱变剂。大多数诱变剂在诱发生物体发生突变的同时还造成生物细胞的大量死亡，因此，诱变剂都是一些剧毒的化学物质，具有致癌致畸的特性。诱变剂可分为物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂三大类。常见的物理诱变剂有：紫外线(UV)、χ射线、γ射线、快中子等，其中以紫外线应用最为普遍。化学诱变剂可分为四大类：第一类，脱氨基诱变剂，如亚硝酸、羟胺；第二类，烷化剂类化合物，如氮芥(NM)、乙烯亚胺(EI)、硫酸二乙酯(DES)、甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硝基胍(NTG)等；第三类，碱基天然类似物，如5－溴尿嘧啶(5－Bu)、2－氨基嘌呤(AP)；第四类，移码诱变剂，如吖啶橙、吖啶黄。生物诱变剂应用的较少，它实际上是一段DNA片段，如转座因子，Is、Tn、Mu。此外还有其它的诱变因素，如抗菌素、除草剂、脱氧核糖核酸等。当这些诱变剂渗入生物细胞后，便可作用于遗传物质DNA，改变细胞遗传物质的正常结构。

　　不同的诱变剂其作用机理及引起的生物学效应是不同的。诱变剂的作用机理主要有以下几类。

　　1.碱基置换

　　即DNA分子中的一对碱基被另一对碱基所置换。如原来是AT，突变后变为GT。一对碱基被改变叫点突变，多对碱基被改变叫多点突变。点突变对DNA来说属微小损伤。能引起碱基对置换的诱变剂主要有亚硝酸、羟胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝酸胍、乙烯亚胺、氮芥等。如亚硝酸作用的机理主要是脱去碱基分子中的氨基，使腺嘌呤(A)脱去氨基后变成次黄嘌呤(H)，胞嘧啶(C)变成尿嘧啶(U)，鸟嘌呤(G)变成黄嘌呤(X)。生物细胞经亚硝酸处理后，在DNA复制时，脱去氨基变成次黄嘌呤的腺嘌呤不能按原来的配对原则与胸腺嘧啶(T)配对，而只能与胞嘧啶(C)配对，同理，胞嘧啶脱去氨基转变成尿嘧啶，不能与鸟嘌呤配对，只能与腺嘌呤配对，结果便造成AT→HC→GC和GC→UA→TA的碱基对转换，从而引起遗传信息的错误而造成突变。此外碱基类似物也能引起碱基对的转换，但与上述相比，它不是直接作用于碱基使碱基改变，而是通过代谢渗入DNA分子中，当DNA再次复制时间接引起碱基对转换。

　　2.移码突变

　　移码突变也属于DNA分子的微小损伤。是指DNA链上失去或增加一个或几个碱基造成的mRNA的译框的改变，无论前译或后译，所翻译出的蛋白质都会出现错误。

　　例：

正常mRNA的移读框为　AUG　AG*U　UUU　AAA　GAC
　　　编码AA　　　　Met　Ser　 Phe　Lys　Asp
　缺矢后移读框为　　AUG　AUU　 UUA　AAG　AGG
　　　编码AA　　　　Met　Ile　 Phe　Lys　Thr

　　在发生移码突变时，如果加进一个碱基又失去一个碱基，则密码子可又恢复正常。如果加进或缺失3个或3个的倍数，则只会打乱一小段码组，其余的仍为正常的密码子。造成移码突变的诱变剂，主要是一些吖啶类物质，如吖啶黄、吖啶橙、2－氨基吖啶等。这类化合物的分子结构为平面三环结构，与核酸中的碱基很相似，能插入DNA两相邻碱基对之间，使DNA链拉长，原来两碱基对距离为3.4埃，当加入一个吖啶类化合物后则变为6.8埃。由于吖啶类化合物的插入，造成DNA碱基对上碱基的添加或缺失，这就在DNA复制时，突变点以下的三联体密码子的改变而发生突变。生物诱变剂本身就是一段DNA，插入后也能引起移码突变。

　　3.染色体畸变

　　某些强烈的诱变因子如X射线、亚硝酸等除了引起点突变以外，还会产生DNA分子的大损伤，导致染色体数目的变化及结构的改变。染色体结构改变有如下几种类型：
　　①、缺失：染色体某一段丢失。
　　②、重复：染色体某一段出现重复。
　　③、倒位：染色体某一段正常顺序发生颠倒。
　　④、易位：一条染色体的片断搭接到另一条同源染色体上去。每种生物的每个细胞都有一定数目染色体，各个染色体的形状也是恒定的。所以如果它们的数目和结构改变了，就会出现可遗传的变异。各种诱变剂虽然作用机理不同，但大多都有多种功能。如甲基磺酸乙酯，既能诱发碱基对的转换，又能诱发染色体的畸变。紫外线作用于DNA可引起DNA链的断裂、DNA分子内和分子间的交链、核酸和蛋白质的交链、胞嘧啶的水合作用以及胸腺嘧啶形成二聚体等。诱变剂对DNA造成损伤的程度，取决于诱变剂量。

　　从上述诱变剂作用机理看，诱变剂渗入细胞后，接触生物体的遗传物质而使其发生改变。但对生物体来说，它们也有对DNA损伤的修复作用。因此诱变剂所造成的DNA分子某一位置的结构改变通常称为前突变，这一突变可以通过DNA分子修复而成为真正的突变；也可通过修复变为原结构并不发生突变。常见的一种修复作用就是光复活作用。生物体细胞受损伤后能产生光复合酶，该酶能与受伤的DNA结合，行使核酸内切酶作用，切除突变部分，以另一联为母联重新合成DNA。该酶在黑暗的条件下无活性，光照条件下能激活光复合酶。所以，对诱变材料进行诱变处理时，需在暗室红光下进行，处理后还要用黑纸包严，可提高突变频率，防止光修复作用。生物体的修复系统还有许多，如暗室修复、重组修复、SOS修复等。

　　二、基因突变的规律

　　整个生物界，由于它们的遗传物质相同，因此，基因突变都遵循着相同的规律。

　　1.突变的方向与生物所处的环境不对应。例如抗药性突变并非因接触药物而引起。任何一种诱变剂都能诱发任何一种突变型，要想得到特定表型效应的突变，是靠不同的筛选方法实现的。

　　2.突变是随机发生的。即突变发生的时间及个体都具有随机性。

　　3.突变仅以很低的频率出现于生物体中。

　　4.突变发生后，可以一定的频率发生回复突变，恢复原有性状。

　　三、诱变育种的几个基本问题

　　1.诱变剂的选择

　　诱变剂选择的依据主要是根据实际操作的方便程度和已成功的经验尽可能的选择简便有效的诱变剂。同时在了解诱变剂作用机理的基础上，可考虑诱变剂复合使用。因为不同诱变剂对DNA分子作用的“热点”(DNA分子易发生突变的位点)不同。复合使用可弥补因一种诱变剂多次使用而产生“热点”饱和。如紫外线主要作用在DNA分子中的嘧啶上，而亚硝酸则主要作用在DNA的嘌呤上的。紫外线和亚硝酸复合作用，使突变谱变宽，提高诱变效果。

　　2.诱变剂量的选择

　　要选用最适的诱变剂量，剂量的大小一般是以诱变后的杀菌率来确定的。剂量大则细胞死亡率大，剂量小则相反。剂量大小的确定应以能够提高正变株变异频率为最适剂量。正变是指诱变处理后，其机体的某个或某一些生物活性有明显增加，负变则是有明显减弱，甚至丧失。近年来，根据对紫外线、x射线、激光和乙烯亚胺等诱变剂的研究，发现正变多出现在偏低的剂量中，而负变则往往出现在偏高的剂量中。因此，目前都倾向于采用较低诱变剂量来处理。如紫外线过去选用杀菌率为99.9%的剂量，而近年来采用的杀菌率为30%～70%。由于每种诱变材料的最佳剂量差异很大，故在选择合适的剂量时，必须通过大量的预备试验方能找出。一般认为，如果菌株不很稳定，要求其稳定地提高产量或改变品质，宜用缓和一些的因子，剂量低一些为好。如果出发菌株比较稳定，又要求突变幅度大，则应考虑诱变能力强的诱变剂和高的诱变剂量，使其遗传物受到强烈的冲击而发生大的改变。化学诱变剂的剂量，通常通过溶液的浓度(0.01～1M)、作用时间和处理温度来控制。使用的浓度越高，杀菌率越高。物理诱变剂常用的是紫外线，紫外线的绝对剂量单位是尔格/厘米2，但不易掌握和计量，紫外线的剂量大小取决于灯管的功率、灯和被照射物之间的距离及照射的时间。若灯管的功率、照射距离固定，那么剂量就和照射的时间成正比，也就可以用照射时间作为相对剂量。在具体操作中，常用15W波长为2537À的紫外灯管，照射距离控制在30cm以内。

　　3.选择出发菌株

　　出发菌株就是用于诱变的原始菌株，选好出发菌株有助于提高育种效果。实践证明，选择已在生产上应用过的、发生了自然变异的菌株；选择具有生长速度快、营养要求低、出菇早、适应性强等有利性状的菌株；选择对诱变因素较为敏感的菌株等，往往能收到较好的效果。

　　4.诱变材料的选择

　　为使每个细胞均匀接触诱变剂，达到较好的诱变效果，用于诱变的材料应呈单细胞，分散状态，这样不仅可以使细胞均匀地接触诱变剂，还避免了多细胞体系中，正常细胞对遗传基因已发生突变细胞的掩蔽作用。

　　不同食用菌的生活史有差异，在诱变材料选择和育种程序上也有差异。草菇是初级同宗结合的食用菌，由担孢子萌发而来的单核菌丝具结实性。因此，可直接处理担孢子，并能直接筛选那些符合育种目标的菌株。对于异宗配合的担子菌，如香菇、平菇等，以它们的担孢子为诱变材料时，单核菌丝不能结实，不能直接进行菌种选育，还必须通过杂交才能产生结实性菌丝。也就是说，诱变的直接产物是杂交育种的材料。

　　去壁的原生质体不仅呈单细胞分散状态，而且除去了细胞壁的阻挡，诱变剂更容易接触细胞内的DNA，若处理由双核菌丝体制备的原生质体，它的再生菌株可直接进行菌种的筛选，大大地简化了异宗配合食用菌诱变育种的程序。

　　诱变材料的生理状态与诱变效应密切相关。各种诱变剂对菌株的诱变效应虽然不尽相同，但有一点是共同的，即诱变剂对DNA处于转录状态或翻译状态的效应要比处于静止状态或休眠状态敏感得多。要使待处理的诱变材料达到转录或翻译的生理状态，对于担孢子，应考虑采用预培养担孢子促其萌发；对于原生质体，应采用幼嫩、处于对数生长期的菌丝体作为制备原生质体的材料较好。

　　5.影响诱变效果的外部条件

　　诱变剂的诱变效应同样受到培养条件、pH、氧、可见光等外部条件的影响。光对诱变后的影响，前面已谈到。在用亚硝基胍(NTG)进行诱变处理时，不能用中性条件，而应用酸性或碱性条件，因为NTG在中性条件下的诱变效应很弱。在用碱基类似物进行诱变处理时，必须创造天然碱基贫乏的环境，因此，平板培养基中，不应含有机氮源等富含天然碱基的成份，而应用合成培养基添加碱基类似物来培养，以迫使菌种在生长过程中为了合成DNA的需要而错误地吸收碱基类似物，同时，也可以用孢子进行饥饿萌发处理。有关这些问题都可在处理前详细查阅有关文章和资料。

　　四、诱变处理后的筛选

　　诱变处理后，在群体中将会出现各种各样的突变类型，如抗药性突变、形态突变、温度突变以及各种生理生化突变型等。要想得到特定表型效应的突变型，需要采用不同的筛选方法进行筛选。

　　1.营养缺陷型菌株的筛选

　　营养缺陷型是指经处理后，原菌株失去合成某些必须营养物质的能力。该菌株只能在完全培养基上或在添加相应营养物质的基本培养上才能正常生长。变异前的原始菌株常称为野生型或原生型，变异后的菌株则为营养缺陷型。营养缺陷型菌株筛选用到的培养基包括基本培养基(MM)，完全培养基(CM)，补充培养基。

　　凡是能满足野生型菌株最低营养需求的培养基称为基本培养基(MM)，这种培养基一般以无机氮为唯一氮源。培养基中，富含一些氨基酸、维生素和碱基等天然有机物质(如蛋白胨、酵母膏等)，可以满足缺陷型菌株生长的培养基称为完全培养基(CM)。在基本培养中有针对性地加入某一种或几种营养成份，以满足相应的营养缺陷型菌株的生长的培养基称为补充培养基。营养缺陷型菌株的筛选就是通过采用不同培养基而进行的，它经过   淘汰野生型，检出缺陷型，鉴定缺陷型等一系列程序。

　　淘汰野生型是将诱变处理后的孢子在基本培养基中进行培养，此时野生型孢子萌发形成菌丝体，再通过过滤除去野生型。检出缺陷型即将含有缺陷型孢子的滤液涂布于完全培养基上让其生长，然后再回接入基本培养基上进行确认。鉴定缺陷型是用补充培养基鉴定出是何种营养物质的缺陷型。

　　2.抗药性突变菌株的筛选

　　抗药性突变菌株的筛选则是在培养基中加入某种药物造成野生型菌株不能生长，而发生抗性菌株能生存的原理进行检出的。常用的方法是梯度培养皿法，梯度培养皿法是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度剃度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液，经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤就可定向筛选到抗药性突变菌株。诱变处理担孢子后，筛选用于杂交的单核菌丝，目前尚无一定的筛选标准。诱变处理双核原生质体，再生菌株因具有结实性，可根据育种目标，直接进行筛选。筛选时也可借鉴其它微生物的“多轮”筛选方案进行筛选。第一轮：出发菌株诱变处理 →挑取20个菌株初筛、筛生产检验 →选出5株复筛、稳定性检验 →选1～2个稳定菌株。第二轮：1～2个出发菌株再次诱变 →挑取20个菌株初筛、筛生产检验 →选出5株复筛、稳定性检验 →优良菌株。稳定性检验要做两次以上，必要时还可以进行第三轮、第四轮诱变处理。突变后的菌株，通常对诱变剂较为敏感，如此反复几次诱变处理，便可选出较为理想的优良菌株。