茯苓的发酵罐补料液体发酵和摇瓶补料培养液体发酵
李羿 ，万德光，杨胜
(1．成都医学院药学系，四川成都610083；2．成都中医药大学药学院，四川成都61OO75) 药物生物技术
【摘要】本文在茯苓摇瓶液体发酵条件研究的基础上，进一步探讨了茯苓的摇瓶补料培养液体发酵和发酵罐补料液体发酵的发酵工艺。新发酵工艺缩短了茯苓液体发酵的时间，并提高了茯苓菌体产量。
【关键词】茯苓；液体发酵；发酵条件；补料；发酵罐
茯苓来源于多孔菌科真菌茯苓［Poria cocos (Schw.) wolf］的菌核，属药食两用的大宗药材,具有利水渗湿、健脾安神的功效。传统的茯苓栽培法存在生产周期长、产量不高及松材消耗量大等缺点，且不利于对我国自然资源和生物多样性的保护。用液体发酵培养及分离提取等新技术来生产茯苓，可连续地、大规模地进行工业化生产，大大缩短生产时间，并可节省大量的木材。茯苓的液体发酵正越来越成为大家关注的研究热点［1，2］。本文在茯苓摇瓶液体发酵条件研究的基础上［3］，探讨了茯苓的摇瓶补料液体发酵，并进一步在发酵罐中研究了茯苓补料液体发酵，为茯苓相关保健食品和药品的开发打下良好的基础。
1 材料和主要仪器
1.1 菌种
四川农科所提供的茯苓（Poria cocos）斜面菌种，4℃低温保存，6个月转管一次。由斜面菌种制作甘油菌-30℃冷冻保藏［4］。
1.2 主要仪器与试剂
全温振荡器（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；NBS BIOFLO Ⅲ发酵罐；离心机 BECKMAN J2-HS；电子天平 Sartorius BP121S。YEAST EXTRACT OXOID LTD.；TRYPTONE OXOID LTD.；葡萄糖、K2HPO4和MgSO4.7H2O均采用国产分析纯。
1.3 培养基
1.3.1 种子培养基 葡萄糖20g，酵母浸膏4g，蛋白胨5g，K2HPO4 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，初始pH值5.5，蒸馏水1L。1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20min。
1.3.2 摇瓶发酵培养基 葡萄糖20g，酵母浸膏3.5g，蛋白胨4.5g，K2HPO4 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，初始pH值5.5，蒸馏水1L。1.05 kg/cm2，121.3℃灭菌20min。
1.3.3 摇瓶补料培养基 葡萄糖20g，蒸馏水100ml。0.56kg/cm2，112.6℃灭菌30min。
1.3.4 发酵罐发酵培养基 葡萄糖100g，酵母浸膏17.5g，蛋白胨22.5g，K2HPO4 5g，MgSO4.7H2O 2.5g，初始pH值5.5，蒸馏水4.05L。1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20min。
1.3.5 发酵罐补料培养基 葡萄糖100g，蒸馏水600mL。0.56kg/cm2，112.6℃灭菌30min。
2 方法
2.1 茯苓摇瓶液体发酵菌种的制备
在250ml三角瓶中装入50ml液体种子培养基，按0.5％的比例接种冷冻甘油菌，25℃摇瓶振荡培养2d作为液体菌种备用。
2.2 茯苓摇瓶补料液体发酵
在2L三角瓶装入360ml液体摇瓶发酵培养基，以7％的比例接种液体菌种，培养温度为26℃，培养基初始pH值为5.5，摇瓶转速为150r/min的培养条件下进行摇瓶培养，摇瓶培养时间为7d。在葡萄糖总浓度为4％的条件下，在茯苓液体发酵的不同培养时间，分别以1%葡萄糖浓度（20ml补料培养基）分两次补糖或以2%葡萄糖浓度（40ml补料培养基）一次补糖。
2.3 茯苓发酵罐液体发酵菌种的制备
在1L三角瓶中装入350mL液体种子培养基，按0.5％的比例接种冷冻甘油菌，25℃摇瓶振荡培养2d作为液体菌种备用。
2.4 茯苓发酵罐补料液体发酵
在火焰保护下，将350ml发酵罐种子液接种到发酵罐内。将发酵温度设定为26℃，pH值设定为5.5，搅拌转速和通气量根据溶氧水平的高低而调整。在葡萄糖总浓度为4％的条件下，在茯苓液体发酵第48、60、72和84h时，由蠕动泵分四次将0.33%的葡萄糖浓度（100ml补料培养基）或0.67％的葡萄糖浓度（200ml补料培养基）的补料培养基滴加入发酵罐培养液体内。同时，分别考察了不同补料条件下茯苓发酵罐液体发酵的最佳发酵终点。
2.5 菌丝称重
发酵液6000r/min离心15min，收集沉积的菌丝球60℃烘干至恒重，用精密天平称重。
3 结果与讨论
3.1 茯苓摇瓶补料液体发酵
以初始葡萄糖浓度为4％，不补糖发酵为对照。以初始葡萄糖浓度为2％，研究在不同时间补糖和以不同方式补糖对茯苓发酵水平的影响。从实验结果可知（见表1），在发酵培养第60h和第72h，分别以1%的葡萄糖浓度补糖效果最佳。
表1 不同时间和不同补料方式对茯苓的摇瓶补料发酵的影响
3.2 茯苓摇瓶补料发酵讨论
碳源浓度对茯苓液体发酵的影响较大。初始糖浓度对发酵有一定的影响，糖浓度过高，将抑制茯苓的生长，但糖浓度过低，由于碳源供应不足，也将使茯苓生长受到抑制。茯苓进入对数生长期后，适当补糖可提高茯苓发酵产量。
在不同的培养时间补糖对茯苓生长有一定的影响，补料时间太早，碳源未很好地消耗而不利于茯苓的生长；而补料时间太晚，则又未能及时满足茯苓生长对碳源的需求。另外，在补糖总量相同的情况下，不同的补糖方式对茯苓生长也有一定的影响，相对于一次以2%的葡萄糖浓度补糖而言，分二次以1%的葡萄糖浓度补糖效果更佳。这也提示发酵培养基营养成份的相对稳定有利于茯苓的生长，最优的补糖方式应根据茯苓发酵过程中碳源消耗速率进行连续的滴加补料。
3.3 茯苓发酵罐补料液体发酵
在茯苓的摇瓶液体发酵放大培养及摇瓶补料液体发酵研究的基础上，探讨了茯苓在发酵罐中的液体发酵放大培养工艺。其中重点考察了在不同的时间和以不同葡萄糖浓度的补料液连续滴加补料对茯苓液体发酵的影响。从实验结果可知（见表2），在发酵罐中连续滴加补料发酵较摇瓶液体发酵放大培养，菌体产量都有不同程度的增加。在发酵培养第48、60、72和84h时，分别以0.33%、0.67%、0.67%和0.33%的葡萄糖浓度补料效果最佳，菌体产量较摇瓶液体发酵放大培养提高11.27％。同时，也考察了不同时间和不同葡萄糖浓度补料对发酵终点的影响。从实验结果可知（见表3），不同时间和不同补料方式对茯苓发酵罐液体发酵终点有一定影响，但对茯苓发酵罐液体发酵终点影响并不大。
表2 不同时间和不同补料方式对茯苓发酵罐液体发酵的影响
综合考虑不同时间和不同补料方式对茯苓发酵罐液体发酵菌体产量和发酵时间的影响，可见在发酵培养第48、60、72和84h时，分别以0.33%、0.67%、0.67%和0.33%的葡萄糖浓度补料为最佳发酵工艺。
3.4 茯苓的发酵罐液体发酵讨论
发酵罐的培养温度和pH值能通过温度探头和pH探头实现动态监控，并能使温度和pH值维持在。最佳值，有利于茯苓的生长。在摇瓶液体培养中，摇床的转速保持不变，因而溶氧水平的高低无法控制；而在发酵罐液体发酵中，氧气的传递效率远高于摇瓶发酵，且溶氧水平能通过调节搅拌的转速和通气量达到很好的动态控制，因此，发酵罐液体发酵的溶氧水平比摇瓶培养更适合茯苓生长。茯苓能在发酵罐内处于最适温度、酸碱度、氧气和碳氮比等条件下生长，呼吸作用所产生的代谢废气又能及时排放，因此新陈代谢旺盛，菌丝分裂迅速，在短期内能获得大量的菌丝体。另外，发酵罐的补料可通过调节蠕动泵的转速而缓慢滴加补料液，优于放大培养的一次性补料方式。
表3 不同时间和不同补料方式对茯苓发酵罐液体发酵终点的影响
总之，发酵罐的液体发酵是一种较先进的茯苓生产技术，较摇瓶补料液体发酵大大缩短了发酵时间，使发酵时间从168h缩短为120h；另外，发酵罐的补料液体发酵还提高了茯苓的生物量，使菌丝干重从10.74g/L增长到11.95g/L，菌体产量提高率达11.27％。
致谢：成都地奥制药公司的刘忠荣博士、吴洽庆博士为本论文的完成提供了所需的实验条件和宝贵的建议。对此，作者表示感谢!
【参考文献】
［1］王谦,冀宏,丁万杰,等.茯苓的发酵研究及其动物免疫学观察［J］．中国食用菌,2002,21(2):41-42.
［2］邵伟,乐超银,熊泽,等.茯苓液体发酵条件的研究［J］．食用菌，1999,4:2-3.
［3］李羿,万德光,裴瑾,等.茯苓液体发酵条件的研究［J］．成都中医药大学学报,2005,28(1):52-55.
［4］李羿.茯苓优良菌种的选育、保藏和液体发酵的研究［D］．成都中医药大学博士论文,2005:15-18.
