摘要：目的研究松茸菌丝体液体发酵方法和最佳条件。方法经RAPD-PCR 分析确认松茸菌丝体菌种，研究松茸液体深层发酵过程中菌丝体的生物量、残糖浓度和pH随时间变化的过程；比较不同种龄对菌丝体积累的影响，确立最佳接种种龄；比较不同初始糖浓度发酵过程的结果，运用中间补糖的方法，确定最优的补糖时间。结果最佳接种种龄为6 d；初始糖浓度较低有利于缩短松茸种子液生长的延迟期，较高则可使菌丝体在较长时间保持生长并获得较高的生物量产出。d 12 为最优补糖时间，在摇瓶体系中培养24 d最终得到12.77 g/L的菌丝体生物量。结论最佳培养条件下，采用中间补糖法适合液体发酵过程中松茸菌丝体的积累。
 
　　关键词：松茸；菌丝体；种龄；补料培养；液体发酵

　　松茸（Tricholoma matsutake）是与松树共生的珍稀食、药用外生菌根真菌，有很高的营养价值和特殊的药用效果。由于野生松茸资源已经日渐枯竭，人工培养尚无法获得松茸的子实体，因此液体深层培养松茸菌丝体，提取生理活性物质并进行深加工越来越受到关注。目前对松茸菌丝体培养的研究主要集中在松茸菌丝的营养生理、液体条件下培养基成分的优化以及培养条件的考察等方面[1-3]。本实验采用了经RAPD-PCR 分析确认的松茸菌丝体菌种，研究了松茸在摇瓶中液体条件下各生长参数的动态变化。发酵过程中采用中间补料的方法，获得了较高的菌丝体生物量，为大规模液体深层发酵生产提供了依据。
　　
　　1材料与方法
　　
　　1.1菌种来源
　　采集我国东北延边地区产的松茸子实体，经组织分离获得菌丝体。纯培养后，经RAPD-PCR（随机引物聚合酶链反应) 分析DNA进行亲菌鉴定，确认为松口蘑菌丝体菌种[4]。

　　1.2培养基
　　PDA 培养基用于斜面菌种培养。液体种子培养基（g/L）是葡萄糖20 , 酵母浸粉1，蛋白胨2，NH4Cl 1，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，维生素B1 0.05，pH自然；发酵培养基（g/L）是葡萄糖（据实验要求而定），酵母浸粉2，蛋白胨2，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，维生素B1 0.05，pH 5.0。
　　1.3方法
　　1.3.1培养方法液体种子培养：用直径10 mm的打孔器将生长旺盛的固体琼脂菌苔切成大小一致的菌块，接种灭菌后的液体种子培养基，菌块要薄以使其漂浮在液面上。用500 mL 三角瓶，装液量100 mL ，22 ℃，50 r/min条件下摇床避光培养。
　　发酵培养：用250 mL 三角瓶，装液量50 mL，液体菌种接种量10 %（去除种子培养液中的固体菌丝块和碎片），22 ℃，70 r/ min 条件下摇床避光培养。
　　取样测定：在每个取样期取3瓶样品做平行测定，以平均值作为测定结果。
　　1.3.2测定生物量40目尼龙滤网过滤培养液，分离菌丝体和发酵液。菌丝体经去离子水冲洗数次，60 ℃恒温烘干至恒重，分析天平称重。测定发酵液pH值及残糖浓度。
　　1.3.3测定残糖浓度费林试剂法每组平行测定6~8次后取平均值。
　　1.3.4显微观察菌丝体取发酵液于载玻片上，乳酸苯酚棉蓝染色涂片，光学显微镜下观察。

　　2结果
　　
　　2.1最佳种龄
　　以相同的接种和培养条件，分别选取种龄为6，9，11 d 的液体种子，接种于摇瓶发酵培养，测定发酵过程中生物量、残糖和pH的变化，结果见图1、图2。

 
　　
　　图1　种龄对菌丝体生物量和残糖变化的影响