虫草菌液体悬浮培养条件研究
马风琴 何桂芳 赵金萍
(宁夏贺兰山国家级自然保护区管理局,宁夏 银川 750021)
摘要:本文采用单因素实验对虫草菌的液体培养条件进行优化,确定了虫草菌的最优培养条件为:培养温度24℃、培养基初始pH值6.0,500mL摇瓶装液量150mL摇床转速150r/min。在此条件下培养96h,菌体干重最高达到10.43g/L。试验结果为进一步开展虫草菌的大规模培养提供了一定的技术参考。
关键词:虫草菌,液体悬浮培养,培养条件
Abstract
In thes paper, the cultivation conditions of Cordyceps sinensis were optimized by single factor experiments. The optimum cultivation conditions of Cordyceps sinensis were as follows: 24℃of cultivation temperature, 6.0 of initial pH value, 150mL/500mL of the medium volume in the flask and 150 r/min of rotation speed. In the optimum cultivation conditions, biomass of mycelium reached to 10.43g/L after cultured 96h. The results offered some references to the further mass culture of Cordyceps sinensis.
Key words: Cordyceps sinensis, liquid suspension culture, culture conditions
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)又名虫草,是麦角科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上形成的子座及幼虫尸体的复合物[1,2],是一种重要的药用真菌。天然冬虫夏草由于其严格的寄生性及特殊的生长环境,造成天然资源十分紧张,加之近年来对野生虫草的滥挖滥采,造成自然界中野生虫草资源越来越少,目前已经濒临灭绝状态[3]。然而随着市场的需求量的不断增大,野生虫草已经远远不能满足市场的需求。
对虫草菌进行液体深层培养,大量生产菌丝体,并从菌丝体以及从培养液中提取虫草有效物质,可以避免人工栽培过程周期长,易受气候、土壤和病虫害影响等不利因素,而且通过筛选高产菌株,控制培养条件可以获得较高浓度的生物活性物质,更有利于大规模工业化生产,是一种非常有应用前途的方法[4,5,6]。目前,已有一些以虫草菌营养物为原料的产品在市场销售。
虫草菌生长受到其培养条件的影响,对培养条件进行优化可以显著提高虫草菌的产量[7,8]。本文采用摇瓶培养的方法,对液体悬浮培养条件下虫草菌的生长规律进行研究,并对虫草菌的培养条件进行优化,为虫草菌的规模化培养和工业化生产提供参考资料。
1、材料与方法
1.1 菌种
蛹虫草(Cordyceps sinensis),由宁夏大学生物发酵研究所提供。
1.2 培养基
①、斜面培养基:马铃薯200g,去皮切成小块,加入1000mL水中煮沸30min,三层纱布过滤,滤液再用9层纱布过滤,取滤液,加入葡萄糖20g,琼脂粉20g,定容至1000mL。
②、液体培养基(g/L):马铃薯200g(制备浸提液,方法同斜面培养基),葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO4 3.0g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L。
1.3 培养方法
种子培养:从斜面菌种中用接种钩切约1cm2菌种块接入装有液体培养基的250mL摇瓶中,摇振培养72h。
发酵培养:500mL三角瓶,根据试验设计盛装不同体积培养基,10%接种量接种种子液,置不同培养条件下培养96h。
1.4 菌体量测定
取100mL发酵液,4000r/min离心20min,弃上清液,水洗3次,离心收集菌体,80℃烘干至恒重,干燥器中冷却到常温,称量。
2、结果与讨论
2.1 虫草菌生长曲线
500mL三角瓶,装液量150mL,24℃,150r/min摇振培养,结果见图1。
从图1中可知,0~24h虫草菌生长缓慢,为延滞期,24h后菌体迅速生长,96h时菌体干重达到最大值6.95g/L,之后菌体量随培养时间的延长而有所下降。
图1 虫草菌生长曲线
2.2 培养温度对冬虫夏草菌生长的影响
500mL三角瓶,装液量150mL,分别在20、22、24、26、28℃条件下,150r/min摇振培养96h,测定生物量,结果见图2。
图2 不同培养温度对虫草菌生长的影响
在20℃、22℃、24℃、26℃、28℃5个不同温度下培养96h,菌体量分别为8.72、10.25、10.43、7.41和5.70g/L。从实验结果可知,较低的培养温度有利于虫草菌生长,其培养的最适温度应为24℃。
2.3 初始pH值对冬虫夏草细胞生长的影响
500mL三角瓶,装液量150mL,培养基初始pH值分别调节为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5,24℃,150r/min摇振培养96h,测定菌体量,结果见图3
图3 培养液初始pH值对虫草菌生长的影响
当培养液初始pH值低于6.0时,虫草菌生物量随着培养液初始pH值的升高而增加,初始pH值为6.0时获得最大菌体干重为10.15g/L,当培养液初始pH值进一步升高时,菌体生物量开始下降,因此,虫草菌培养液的最适初始pH值为6.0。
2.4 装液量对冬虫夏草细胞生长的影响
500mL三角瓶,装液量分别为100mL、150mL和200mL,24℃,150r/min摇振培养96h,测定生物量,结果见图4。
图4 装液量对虫草菌生长的影响
培养到第96h,50mL、150mL和200mL三个装液量条件下,菌体干重分别为10.76g/L、10.05g/L和7.51g/L。在摇床转速一定的情况下,摇瓶装液量直接影响到培养液的溶氧值。装液量越大,则溶氧值越低。在装液量为200mL/500mL时,由于培养液中溶氧不足,因而菌体生物量最低。而装液量为100mL/500mL时,由于培养液中溶氧充分而获得了最大菌体生物量。与装液量为100mL/500mL相比,装液量为150mL/500mL时菌体生物量略有降低,但单位摇瓶产量较高,因此确定500mL摇瓶装液量为150mL。
2.5 摇床转速对虫草菌生长的影响
500mL三角瓶,装液量150mL,培养基初始pH值6.0,培养温度24℃,分别在100、150和200r/min三个转速下摇振培养96h,测定生物量,结果见图5。
图5 不同转速对冬虫夏草细胞生长的影响
摇床转速对虫草菌生长有显著的影响。150r/min时获得的虫草菌生物量最大,而100r/min时获得的生物量最小,这可能是因为100r/min时培养液的溶氧值过低,不利于菌体生长。
丝状真菌在液体深层培养过程中主要以菌丝球的形态生长,菌丝球的形成在一定程度上阻碍氧和营养成分的传递,从而影响菌体的生长。较高的摇床转速有利于培养过程中的混合和传质,但转速过高时由于产生较大的剪切力,对菌体造成伤害,从而影响了最终的生物量。
参考文献
[1] Chiou, W.F, Chang, P.C, Chen, C.F. Protein constituent contributes to hypotensive and vasorelaxant activities of Cordyceps sinensis[J]. Life Sci , 2000,66 (14), 1369~1376.
[2] Tai-Hao Hsu, Li-Hua Shiao, Chienyan Hsieh, Der-Ming Chang. A comparison of the chemical composition and bioactive ingredients of the Chinese medicinal mushroom DongChongXiaCao, its counterfeit and mimic, and fermented mycelium of Cordyceps sinensis[J]. Food Chemistry, 2002, 78:463~469.
[3]肖宏亮等.冬虫夏草及其菌丝体研究进展[J].中国食用菌,1996,16(2):3~5.
[4]余晓斌, 罗长才, 缪静.冬虫夏草多糖提取工艺的优化[J].中草药, 2002,33 (12): 1086~1087.
[5]宾文,于荣敏,白秀峰.人工培养蛹虫草多糖的研究,沈阳药科大学学报[J]. 2000,17(5):361~364.
[6]许周善, 周晓燕.冬虫夏草多糖的研究进展[J].工业微生物, 2000,30(1): 56~57.
[7]余晓斌,罗长才,缪静. pH值对冬虫夏草深层发酵的影响[J].食品与发酵工业,2002,29(3):98~100.
[8]王英臣.关于蛹虫草多糖发酵及培养基的研究[J].中国酿造,2005,10:29~31.