摘要:目的研究松茸菌丝体液体发酵方法和最佳条件。方法经RAPD-PCR 分析确认松茸菌丝体菌种,研究松茸液体深层发酵过程中菌丝体的生物量、残糖浓度和pH随时间变化的过程;比较不同种龄对菌丝体积累的影响,确立最佳接种种龄;比较不同初始糖浓度发酵过程的结果,运用中间补糖的方法,确定最优的补糖时间。结果最佳接种种龄为6 d;初始糖浓度较低有利于缩短松茸种子液生长的延迟期,较高则可使菌丝体在较长时间保持生长并获得较高的生物量产出。d 12 为最优补糖时间,在摇瓶体系中培养24 d最终得到12.77 g/L的菌丝体生物量。结论最佳培养条件下,采用中间补糖法适合液体发酵过程中松茸菌丝体的积累。
关键词:松茸;菌丝体;种龄;补料培养;液体发酵
松茸(Tricholoma matsutake)是与松树共生的珍稀食、药用外生菌根真菌,有很高的营养价值和特殊的药用效果。由于野生松茸资源已经日渐枯竭,人工培养尚无法获得松茸的子实体,因此液体深层培养松茸菌丝体,提取生理活性物质并进行深加工越来越受到关注。目前对松茸菌丝体培养的研究主要集中在松茸菌丝的营养生理、液体条件下培养基成分的优化以及培养条件的考察等方面[1-3]。本实验采用了经RAPD-PCR 分析确认的松茸菌丝体菌种,研究了松茸在摇瓶中液体条件下各生长参数的动态变化。发酵过程中采用中间补料的方法,获得了较高的菌丝体生物量,为大规模液体深层发酵生产提供了依据。
1材料与方法
1.1菌种来源
采集我国东北延边地区产的松茸子实体,经组织分离获得菌丝体。纯培养后,经RAPD-PCR(随机引物聚合酶链反应) 分析DNA进行亲菌鉴定,确认为松口蘑菌丝体菌种[4]。
1.2培养基
PDA 培养基用于斜面菌种培养。液体种子培养基(g/L)是葡萄糖20 , 酵母浸粉1,蛋白胨2,NH4Cl 1,KH2PO4 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,维生素B1 0.05,pH自然;发酵培养基(g/L)是葡萄糖(据实验要求而定),酵母浸粉2,蛋白胨2,KH2PO4 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,维生素B1 0.05,pH 5.0。
1.3方法
1.3.1培养方法液体种子培养:用直径10 mm的打孔器将生长旺盛的固体琼脂菌苔切成大小一致的菌块,接种灭菌后的液体种子培养基,菌块要薄以使其漂浮在液面上。用500 mL 三角瓶,装液量100 mL ,22 ℃,50 r/min条件下摇床避光培养。
发酵培养:用250 mL 三角瓶,装液量50 mL,液体菌种接种量10 %(去除种子培养液中的固体菌丝块和碎片),22 ℃,70 r/ min 条件下摇床避光培养。
取样测定:在每个取样期取3瓶样品做平行测定,以平均值作为测定结果。
1.3.2测定生物量40目尼龙滤网过滤培养液,分离菌丝体和发酵液。菌丝体经去离子水冲洗数次,60 ℃恒温烘干至恒重,分析天平称重。测定发酵液pH值及残糖浓度。
1.3.3测定残糖浓度费林试剂法每组平行测定6~8次后取平均值。
1.3.4显微观察菌丝体取发酵液于载玻片上,乳酸苯酚棉蓝染色涂片,光学显微镜下观察。
2结果
2.1最佳种龄
以相同的接种和培养条件,分别选取种龄为6,9,11 d 的液体种子,接种于摇瓶发酵培养,测定发酵过程中生物量、残糖和pH的变化,结果见图1、图2。
图1 种龄对菌丝体生物量和残糖变化的影响