微生物的纯培养和显微技术

　　一、目的要求
　　通过本章的课堂教学，学生应了解无菌技术的意义、微生物保藏技术及显微镜的原理；掌握进行微生物学研究的基本技术，即无菌技术、纯种分离技术、培养技术和显微技术；熟悉微生物学的基本研究方法和研究手段及显微镜下微生物的形态特点，为后面介绍其他微生物学相关知识打下基础。
　　二、教学内容
　　1.  微生物的分离和纯培养
　　1.1 无菌技术
　　1.2 用固体培养基分离纯培养
　　1.3 用液体培养基分离纯培养
　　1.4 单细胞（孢子）分离
　　1.5 选择培养分离
　　2.  显微镜和显微技术
　　2.1 显微镜的种类及原理
　　2.2 显微观察样品的制备

第一节 微生物的分离和纯培养

　　微生物因个体微小，从而在绝大多数情况下，研究的是群体的属性
　　培养物（culture）：在人为规定条件下，培养、繁殖得到的微生物。
　　纯培养物（pure culture）：只有一种微生物的培养物。
　　微生物是纯培养物时能较好地被研究、利用，所以必须采用纯培养技术而微生物个体太小（µm、nm 级）故采用显微镜方可观察和研究。
　　一、无菌技术（aseptic technique）
　　分离纯化操作而防止其他微生物的侵入，采用无菌技术。
　　无菌技术（aseptic technique）：在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术，称为无菌技术
　　1、微生物培养的常用器皿及其灭菌
　　（1）干热灭菌：
　　①T：150-160℃ for 2h,T ＜170℃,170℃
　　纸张燃烧、应用移液管、平皿（培养皿）等灭菌
　　②灼烧：接种环、针的灭菌
　　（2）湿热灭菌：
　　①间歇灭菌：100℃，15-30min-冷却28-37℃培养24h（重复此过程3次）
　　②高压蒸汽灭菌：121℃，15-30min，通常20min，装于三角瓶、试管中的培养基的灭菌，采用适宜塞子塞好，防止染菌。

　　2、接种操作
　　用接种环或接种针（易于迅速加热或冷却的金属材料制成）将微生物从一个培养器皿转移到另一个培养器皿，液体培养物采用无菌吸管或移液管操作。所有操作必须在无菌条件下进行，这样避免引起染菌。
　　无菌塞或无菌箱一般用于空气中的微生物，采用紫外灭菌或采用化学试剂，如高锰酸钾、甲醛等灭菌。

　　二、用固体培养基分离纯培养

　　单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长，繁殖到一定程度可形成肉眼可见的，有一定形态结构的细胞生长　群体，称为菌苔（lawn）。
　　不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般具有稳定特征，可成为对该微生物进行分类、坚定的重要依据。
　　平板，即培养平板（culture plate）
　　1、稀释倒平板法（pour plate method）
　　将分离物稀释→取少量与50℃熔化态琼脂培养基混合，摇匀→倒平板→培养→稀释得当会有单个菌落→挑单个菌落，重复以上操作得纯培养
　　缺点：热效菌不适用，严格好氧菌生长受影响
　　2、涂布平板法（spread plate method）
　　倒平板→移菌液→涂布棒涂布→挑单菌落
　　3、平板划线分离法（streak plate method）
　　倒平板→挑菌落划线→单菌落
　　4、稀释摇管法（dilution shake culture method）
　　较敏感的厌氧微生物：待分离物于50℃熔化琼脂试管中梯度稀释，摇匀、冷凝，于琼脂柱表面倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡混合物，将培养基与空气隔开。
　　培养后，菌落形成在琼脂柱间。
　　单菌落挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡和石蜡盖取出，用毛细管吹无菌无氧空气于琼脂和管壁间，吸出琼脂，于培养皿中用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落移植。

　　三、用液体培养基分离纯培养

　　非所有微生物都能在固体培养基上生长，一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，仍需液体培养基分离。
　　采用稀释法
　　同一稀释倍数的平行试验中，95％表现为不生长，此时长出来的是纯培养物可能性极大。

　　四、单细胞（单孢子）分离

　　稀释法缺点：仅能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类。对于在混杂微生物中占少数的群体，采用单细胞（单孢子）分离法-显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或个体进行培养以获得纯培养。
　　较大微生物借助毛细管，较小微生物借助显微技术。

　　五、选择培养分离

　　1、利用选择性培养基进行直接分离
　　主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件。
　　例蛋白酶产生菌的筛选、高温菌的分离、抗生素抗性菌主的分离等。
　　2、富集培养
　　主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界分离到所需特定微生物。
　　富集条件可根据所需分离的微生物特点从物理、化学、生物及综合多方面进行选择，如湿度、pH、紫外等

　　六、二元培养物

　　培养物中含两种微生物，且有意识地保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。例病毒和其宿主细胞、有寄生或共生关系的其他微生物等。

　　七、微生物的保藏技术

　　菌种保藏机构：
　　中国微生物菌种保藏中心（CCCCM）
　　中国典型培养物保藏中心（CCTCC）
　　美国典型菌种保藏中心（ATCC）
　　令菌株代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠状态，在一定时间内得到保存。
　　1、传代培养保藏
　　保存时间因菌种不同，可数周至数年（一般3个月）
　　缺点：繁琐，易染菌，菌种衰退快
　　2、冷冻保藏
　　将微生物处于冷冻状态，使其代谢作用停止以达保藏目的，一般-70℃冰箱保藏。
　　操作注意点：低温使细胞内水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。采取速冻法（冰晶小而减少损伤）升温时，冰晶会长大，要快速升温。
　　3、干燥包藏法
　　沙土管保存：适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌，放线菌等。菌种至
　　斜面长出大量孢子后，洗下孢子，制悬液，加入无菌的沙土试管中，减压干燥，至水分抽干，最后用石蜡、胶塞等
　　封闭试管口，于冰箱中保存。
　　冷冻真空干燥：加保护剂、冷冻、低温干燥