2.3补料时间对菌丝体生物量和葡萄糖消耗的影响
　　以15 g/L作为初始葡萄糖浓度，根据菌丝体生物量快速积累和残糖大量消耗的时间，分别选取d 12，14，16补糖，以考察不同补料时间对菌丝体生物量积累的影响。补加灭菌后的40 g/L葡萄糖溶液20 mL，并以不补糖的实验组作对照。菌丝体生物量和葡萄糖底物浓度的对比见图4。

图4补料时间对菌丝体生物量和残余葡萄糖浓度的影响

　　中间补加碳源后，菌丝体继续保持较高的生长速率，其最终生物量1组在d 24达到12.77±0.38 g/L；2组在d 27达到11.31±0.24 g/L；3组在d 27达到10.76±0.26 g/L。残糖浓度在补料后随着菌丝体生长以较快的速度下降，接近发酵终点时下降趋于平缓，最终分别达到3.29±0.29 g/L，3.89±0.42 g/L，5.23±0.36g/L。结果表明，中间补加碳源能使菌丝体保持较高的生长速率和菌丝体生物量 ；d 12时补加碳源较为有利，最终菌丝体生物量能达到12.77g/L。d 12时菌丝体生长处于生长旺盛期的中后期，尚未进入平台稳定期，对传质有很大影响的致密菌丝球尚未形成，此时补加碳源能使菌丝体继续保持高速生长的态势，延长菌丝生长旺盛期，最终达到较高的菌丝体量积累。
　　
　　3讨论
　　
　　为了缓解市场需求和有限的自然资源之间的矛盾，人们寄希望于通过液体深层纯培养方法获得松茸菌丝体。人工菌丝体培养的前提是获得松茸的菌种，由于松茸目前尚无法通过全人工方法完成其生活史，即无法培养出子实体，仅靠菌丝体形态、菌落特征难于准确确认分离物是否是松茸纯菌种。我们用的菌种是从野生松茸的子实体中分离得到，并经RAPD-PCR分析确定为原菌株的子代菌丝体。
　　松茸是与松树共生的外生菌根真菌，其菌丝体生长速度极为缓慢，在自然条件下，菌丝体以每年10～15 cm 的速度扩展[5]。在液体深层环境下，相对于其他成功发酵菌丝体的食用菌，松茸菌丝体的萌发生长十分缓慢，接种后一般需5~7 d才能观察到菌丝体萌发生长，所以确定接种种龄非常重要。此外，鉴于松茸菌丝体生长缓慢，本实验选择了速效的葡萄糖作为碳源，以期能在较短的时间内获得菌丝体的积累。考察残糖浓度随发酵时间的变化，几乎所有的实验在到达发酵终点时都未发现葡萄糖浓度到达或接近零点，初始糖浓度较高时最终的残余糖浓度也较高。结合取样测糖时菌丝体形态的观察结果，可能是由于临近发酵终点时，菌丝球已经形成，导致传质阻力增加，菌丝体停止生长，残糖浓度不再降低。我们通过中间补料的方法在摇瓶系统中培养松茸菌丝体，最终在d 24得到12.77 g/L的生物量，后续的工作需要在合适的生物反应器上寻找最优的补料培养方法。
　　
　　参考文献
　　[1]Kawagishi H，Hamajima K，Takanami R，et al. Growth promotion of mycelia of the matsutake mushroom Tricholoma matsutake by D-isoleucine[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2004, 68(11): 2405-2407
　　[2]伦志明，李玉花，傅禄敏. 松口磨对纤维二糖的利用能力[J]. 菌物学报，2004，23（3）：563-567.
　　[3]陈羽，王凤珍，陈应龙. 两个松茸菌株培养条件的研究[J]. 林业科学研究，2000，13（4）：410-415.
　　[4]曾东方，罗信昌，傅伟杰. 松口蘑菌丝体的分离和RAPD-PCR分析[J]. 微生物学报，2001，41（3）：278-286.
　　[5]傅伟杰，许广波，傅民杰，等. 松口蘑的驯化栽培及人工促繁[J]. 中国食用菌，2004，23（2）：3-6.
　　
　　注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”