茯苓液体培养条件研究及其营养浓缩液的相关检测

王谦1，闫蕾蕾1，王超1，冀宏2，丁万杰2，刘传斌3，邢志华3，李宝佳3

1河北大学生命科学学院食药用真菌研究所，保定071002；2河北省微生物研究所，保定071051；3保定市农业科学研究所，保定071000

　　茯苓(Poria cocos)又名茯菟，属担子菌亚门，多孔菌科，卧孔菌属…，是我国传统的常用中药材，具有益脾健胃，安神守心，利水渗温等功能[2]，开发价值及应用前景远大。运用发酵工程手段，可在短时间内获得大量茯苓菌丝体，进而进行工业化开发，这吸引了菌物学工作者的注意。本文报道了在工业发酵条件下茯苓的液体培养情况及其营养浓缩液的相关检测。

　　1　材料与方法

　　1.1　供试菌株

　　茯苓菌株HPC-1，由河北大学生命科学学院食药用真菌研究所提供，4℃低温保存，每6个月转管一次。

　　1.2　主要设备

　　P270双层摇床，武汉科学仪器厂产品；100L和1000L不锈钢通用型发酵罐，镇江东方生物工程设备技术有限责任公司产品；Beckman Du一7型紫外分光光度计，美国Beekman公司出品。

　　1.3　发酵工艺

　　1.3.1发酵培养基在适宜碳氮源试验基础上，确定供试培养基为：玉米粉0.5%，豆饼粉0.5%，葡萄糖2.5%，酵母膏0.3%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.1%，pH自然。

　　1.3.2发酵培养条件菌种使用前于室温下活化过夜，再于25±1℃下，24h前180r／min、其后220r／rain摇瓶培养，培养周期196h。发酵罐培养中，0.11rnPa空消50rain，后0.10mPa实消30min，装液量60%，加消泡剂0.01%，冷却至25℃压差法接种。菌龄96～120h，通气量1：0.5～1：1。经工艺优化筛选试验后确定的茯苓发酵工艺流程。

　　放罐标准为菌丝生物量达到30g/100mL(鲜重)，无杂菌，镜检菌丝无破壁现象，锁状联合丰富。醪液经破壁处理、低温提取、减压浓缩后即获得其营养浓缩液，进而进行相关检测。

　　1.4　分析测试

　　1.4.1　常规分析以80目铜丝网过滤称重，测定菌丝体鲜重；用pHS-3型数字式pH计测定pH值；用菲林法测定还原糖[3]；用酚一硫酸法测定多糖含量[4]；用日立835-50型氨基酸自动分析仪测定氨基酸；用色谱质谱联测分析测定发酵液中的有机酸含量，该检测由河北大学理化中心完成。

　　1.4.2　营养浓缩液的动物试验按照卫生部保健食品功能学评价程序与检测方法中有关内容和试验方法进行抗疲劳作用检测(负重游泳试验)和免疫调节作用检验(迟发型变态反应试验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬红细胞试验)，试验动物由河北医科大学实验动物中心提供。

　　1.4.3　营养浓缩液理化分析及毒性试验试验由河北省卫生防疫站完成，急性毒性试验用霍恩法进行。

　　2　结果分析

　　2.1　摇瓶试验

　　0-48h为适应期，菌丝生长缓慢；48～144h为增殖期，菌丝生长速率加快；144h后则进入稳定期，菌丝生物量基本保持在一个水平(表1)。在正常培养情况下，进入增殖期后伴随着菌丝生物量的增长，pH值急剧下降，降至2.5左右才趋于稳定。

　　大部分食(药)用菌液体深层培养过程中pH值变化不大，相比之下，茯苓液体深层培养情况较为特殊，其还原糖的消耗速率亦较灵芝和金针菇的慢[5,6]，笔者在香菇液体深层培养过程中亦曾发现同样的情况L7J，为此我们测定了发酵液的有机酸组成(表2)。

　　其中，274峰为软脂酸十六烷酸，351峰为硬脂酸十八烷酸，二者均是亚油酸和亚麻酸的重要合成前体，哺乳动物是不能自身合成这些生物膜的重要组成成分的。茯苓液体深层培养过程中产生的软脂酸和硬脂酸不仅具有学术价值，也具有潜在的经济价值。该方向的研究将继续深入进行。

　　2.2　发酵罐培养

　　由于发酵罐培养条件优于摇瓶，因此培养周期较短，120h即可达到30d100mL的生物量指标，放罐进入后处理。研究中发现，将装液量调整为50%后，可通过调整通气量来改善发酵液中的溶氧量。在培养中期停止搅拌以减少机械作用对菌丝的破坏作用，是一项有效的工艺。菌种上罐前经24h肉汤培养，结合镜检确认有无杂菌感染，是一种稳妥的菌种检验方法。

　　2.3　营养浓缩液的相关检测

　　培养120h的茯苓发酵醪液经细胞破壁处理，低温提取，减压浓缩，复配和稳定处理等步骤后即获营养浓缩液。其氨基酸总量≥480mg]lOOmL(其中44%为必需氨基酸)，多糖总量≥5.0mg／mL，总酸≥5.36%，重金属及微生物指标均符合国家标准。毒性检验结果LDso>21.5g/kg，属于安全无毒。

　　2.3.1　茯苓营养浓缩液的抗疲劳作用　经比较，茯苓营养浓缩液可显著延长小鼠游泳耗竭时间，具有明显的抗疲劳作用。

　　2.3.2　茯苓营养浓缩液对小鼠腹腔吞噬细胞吞噬功能的影响试验发现，注射茯苓营养浓缩液组小鼠巨噬细胞的吞噬功能明显高于对照组(表4)，表明该营养浓缩液具有明显提高机体免疫功能的作用。

　　3　结论

　　3.1　在本研究提供的条件下，茯苓菌株HPC-1经发酵培养120h后，生物量≥30g／100mL(鲜重)。

　　3.2　发酵过程中pH骤降，在发酵液中检测到了包括十六烷酸、十七烷酸和十八烷酸在内的有机酸。

　　3.3　营养浓缩液安全无毒，多糖含量≥5.0mg／mL，氨基酸含量≥480mg/100mL，并具有显著的抗疲劳作用和提高小鼠巨噬细胞吞噬功能的作用。

　　致谢：本课题得到河北大学理化中心郭志峰教授、河北医科大学张永健教授大力帮助，在此一并致谢

　　参考文献

　　[1]刘波.中国药用真菌[M].太原：山西人民出版社，1981.34～36.

　　[2]徐锦堂.中国药用真菌学[M].北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997.6.

　　[3]北京大学生物系.生物化学实验指导[M].北京：人民教育出版社，1982.24～27.

　　[4]Dubois M，GilleS KA，HamiIton JK，et a1.C010rimetric method fOr determination 0f sugar a11d related substance[J].Arial_Chem，1956，28(3)：350～354.

　　[5]洪震，卯晓岚．食药用菌试验技术及发酵生产[M]．北京：中国农业科技出版社，1992.66～68.

　　[6]王谦，李育岳，冀宏，等.金针菇的发酵研究及应用初报[J].食用菌学报，1995，2(2)：60～63.

　　[7]王谦，李育岳，冀宏，等.香菇的液体培养及发酵原液的制备[J].河北大学学报，1992，12(4)：85～87.