朱戎 陈向东 兰进（中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京,100094）
摘要:本文综述了药用真菌液体发酵技术研究的进展，指出提高目的产物的主要途径是优化培养基和优化菌种。药用真菌液体发酵培养技术可以进行工业化连续生产，其规模大，产量高、发酵周期短，具有广泛的发展前景。
关键词:药用真菌;液体发酵;产物
液体发酵技术是在抗生素工业发展起来后才运用到药用真菌发酵中的。其优点是可以进行工业化连续生产、规模大、产量高、发酵周期短、生产效益高。药用真菌在液体发酵过程中，除菌丝或孢子会大量增殖外，还会在发酵液中产生多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇、酶、核酸、氨基酸、维生素、植物激素及具有抗生素作用的各种化合物等多种具有生理活性的物质。这些物质分别对心血管、肝脏、神经系统、肾脏、性器官等人体器官具有防病治病的作用，并有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老、抗溃疡等功效。人们对药用真菌的液体发酵，除获得菌丝体外，还以获取上述具有活性的次生代谢产物为目的。现在许多研究表明有很多药用真菌液体发酵的菌丝体多糖含量远高于人工栽培的药用真菌。在液体发酵蜜环菌菌丝体的报道中所提取的粗多糖约为人工栽培的10倍。对灵芝发酵的研究也有类似的报道。近年来，药用真菌发酵技术应用越来越广泛。改进发酵过程中的条件，促进发酵过程朝向提高目的产物的方向进行，提高产物品质，降低发酵成本，使投入产出比达到最小，是液体发酵研究的一个方向。在该领域内，从事液体发酵的研究人员正在试用不同的方法来实现这一目标。
1、培养方法
药用真菌在发酵培养过程中，通过培养基配方比例的调整或培养条件的改变，所得发酵产物会有差异，尤其是对一些次生代谢产物而言，差异显著。在这方面人们对不同的药用真菌进行了大量研究。
1.1灵芝
改变灵芝液体发酵条件，结果表明其最适温度、摇瓶装量、转速、培养初始pH分别为25℃、100～120ml/500ml三角瓶、120～150rpm、4.5～5.0，适宜的碳、氮源分别是玉米粉、黄豆饼粉，最适浓度分别为3%、2.5%。研究还发现摇瓶培养过程中菌丝球直径在0.85～0.9时，菌丝体得率最高。pH值在灵芝深层发酵中对灵芝胞外多糖形成有影响，当起始pH为5.5时，有利于胞外多糖的形成，发酵过程中控制pH4.0时，胞外多糖的产量最大。另外，采用正交设计实验改变发酵条件，筛选出灵芝优化培养基为:葡萄糖3.6%、蛋白胨0.4%、pH6.0、酵母膏0.2%、KH2PO40.1%、MgSO2·7HO2 0.05%、VB10.005%，每升发酵液产干菌丝体15.6g，粗多糖0.72g。
1.2灰树花
灰树花液体深层培养最适宜的碳源为豆粉+麸皮、氮源为蛋白胨、牛肉膏，pH5.3～6.0，通气量为1：（1.0～1.4）。发酵液起始pH为8最适宜，终止pH为3.5，菌丝最适宜生长的pH为5.0。为确定灰树花深层发酵的工艺条件，掌握温度、pH、通气量、培养基黏度、菌龄及接种量对菌丝体生长的影响，经过试验得知，QF培养基，25℃，pH4.5，装量60mL/500mL三角瓶，转速100r/min,接种量≥12%，种子培养基中加0.4%的CMC,可提高菌丝量。培养基添加生长促进剂板栗壳煮汁后，菌丝的增产率达140%。为进一步提高胞外多糖的产量,重复利用第一次发酵后的菌丝体是一种很好的方法。当总糖浓度一定时补料可提高胞外多糖的产量，补糖最佳时机为发酵84小时后补加葡萄糖,使发酵液浓度达5%，可使胞外多糖产量最高达1.3g/L。菌丝体回收利用次数以2次为宜。
1.3蜜环菌
试验中改变蜜环菌液体发酵培养基的碳、氮源浓度，通过测定生长菌丝干重，获得最适培养基配方为：未脱脂蚕蛹粉1.5%，豆饼粉1.5%，蔗糖2.0%，乙醇1.0%。结果显示菌体生物量受氮源影响明显。以廉价易得的农作物产品红薯粉作为碳源菌丝得率为15.4g/L，NH4Cl作为氮源菌丝得率为13.8g/L。研究发现液体摇瓶培养过程中，产生色素和香味物质的多少与培养基的碳、氮源种类有关。研究还发现在培养基中添加10%～30%（V/V）的泥炭水解液对蜜环菌的生物合成有促进作用，振荡培养形成球型菌丝体，静置液体培养有利于菌索形成。
1.4云芝
人体在正常的生命活动中需要多种微量元素，某些处于无机态的微量元素不能被人体直接吸收。利用某些药用真菌作为载体，通过液体发酵培养，可以将不能直接吸收的无机态转化为有机态，成为可直接吸收利用的微量元素。
云芝液体培养富硒的研究解决了这一问题。在云芝的培养基中加入一定浓度的NaSeO，经液体培养后，将所得的菌丝进行测定，云芝菌丝体中有机硒含量随着培养基中添加硒浓度的提高而升高，菌丝体数量明显下降。以硒添加量20mg/k为最佳，富集在菌丝体内硒的浓度是添加浓度的20倍。制成含硒云芝粉适合人体服用。废弃的发酵液还可再用于加进固体养料中栽培其它食用菌。
注意到云芝的特性及食用性，在云芝的生产中采用了悬浮培养法，较其栽培法生产周期大大缩短。制成的浑浊汁成品质量稳定。酸爽柔和，营养丰富，具有云芝独特的风味和药理保健作用。
1.5金针菇
通过单因子试验统计分析，筛选出金针菇FV088的适宜培养基和摇瓶培养条件。试验用培养基选用粮食作物，取材方便便于推广。
在金针菇杂交19号富锌能力研究中发现，添加300～2500mg/kg的锌离子，于26℃，13r/min条件下培养其富锌能力较好。金针菇的生物富集作用受培养基成分、微量元素浓度的影响，提高培养基中蛋白质、脂肪、锌的浓度，有利于金针菇对锌的富集。
1.6羊肚菌
羊肚菌液体摇瓶培养条件及适用培养基的筛选结果表明，PYG培养基（含0.1%酵母提取物的PDA），适宜的液体培养条件为：25℃，100r/min,装量100mL三角瓶，pH7.5。另外通过正交试验筛选的摇瓶培养基为麦芽汁50%，玉米粉1.5%，酵母提取物0.5%，蔗糖1.5%。
1.7其它
研究猴头菌深层发酵过程中pH值、总糖、还原糖、氨基酸态氮、菌丝球的数量、大小等变化，确定了用于配制饮料或营养液的摇瓶培养基及最佳发酵时间，以4%的葡萄糖为碳源，大豆蛋白胨和酵母粉为氮源或再加0.3%CMC,初始pH为4～5，摇瓶培养8天，发酵液有猴头菇的清香味。
分离纯化后的野生蛹虫草斜面菌种，经液体培养获得的菌球，可在米饭培养基上成功地培育出子实体。进一步实验结果显示蛹虫草胞外多糖的最佳培养基为：玉米粉4%，黄豆粉0.6%，酵母汁0.3%，KH2PO40.05%，MgSO20.05%，接种量3%，pH5.5。在25℃培养144小时，胞外多糖产量可达1.83g/L。试验中发现碳源因子对多糖产量影响极显著，C/N比高，有利于次生代谢物的积累。
冬虫夏草是名贵的药用真菌，野生资源被极度采集致使资源愈来愈少，市场货源紧缺。近年来，应用生物技术发酵工程，进行了冬虫夏草发酵生产，其培养基配方为葡萄糖2.5%，蛋白胨0.7%，玉米浆0.5%，酵母粉0.5%，CaCO20.15%，KH2PO40.15%，pH自然，培养的虫草菌丝体含甘露醇3.36%，与天然的冬虫夏草成分相似，用于代替野生冬虫夏草。
2、优化菌种
为了开拓药用真菌的生产潜力，提高液体发酵水平，获得更多的目的产物，除寻找最佳培养条件外，应选育最佳的菌种。在选育优质菌种时通常采用紫外诱变技术。
以灰树花Gr9801为出发菌株，采用紫外线连续诱变，经分离纯化、驯化等方法，以斜面生长速度和液体摇瓶发酵产多糖总量为监测指标，筛选出一株遗传上相对稳定的适应液体培养的灰树花菌株-GrUV04，该菌株在综合PDA培养基上生长速度快，菌体丰满纯白。驯化后在液体培养基中发酵生长力强，生物量达1.97%，发酵多糖总量达216mg/100mL。分别较出发菌株提高129.1%和75.6%。对灵芝原生质体进行了紫外诱变处理，经过粗筛和精筛，选出多糖含量明显高于原始菌株的新品种，经过10代的PDA培养基及摇瓶试验和多次3吨罐的中试试验，表明所得的诱变株确实在产量及多糖含量上超过原来菌株，从小试、中试的结果看该菌株的性状比较稳定。
3、分析手段
随着药用真菌发酵技术的发展，对发酵产物的分析手段也不断提高。在对天然和发酵培养冬虫夏草中的腺苷、尿苷、鸟苷等3种核苷类成分的含量的测定中采用了高效毛细管电泳法。在利用薄层层析法进行灵芝有效成分的定性分析中，选用甲苯-乙酸乙酯-乙酸（12：4：0.5）为展开剂，以硫酸-甲醇（1：1）为显色剂，通过硅胶薄层色谱法由灵芝发酵产物中分离得到3种四环三萜酸，并测定了这3种物质的紫外光谱。在云芝菌丝体提取物云芝糖肽中糖和蛋白质的含量及分子量测定中采用了快速、分辨率高和重现性好的高效液相凝胶渗透色谱法（HPGPC）。用梯度凝胶法分离电泳比较金针菇液体培养菌丝体与子实体的同工酶，电泳凝胶精密度扫描图谱比较表明，菌丝体中SOD同工酶谱带与子实体的基本相同。
4、其它
发酵产物所含成分十分复杂，不同提取方法结果差异很大。对云芝菌株结合蛋白多糖的分析比较中分别采用了热水提取、稀碱提取、乙醇沉淀等方法。结果显示，水提物多糖含量远高于碱提物，碱提物的蛋白含量高于水提物。通过色谱图显示，水提物中的组分数比碱提物少，可见水提物中杂质少于碱提物。
5、小结
药用真菌液体发酵培养技术可以进行工业化连续生产，其规模大，产量高、发酵周期短，具有广泛的发展前景。但是在药用真菌发酵研究中应当注意：1.药用真菌有效成分的研究。发酵液中所包含的成分极其复杂，真正有益的成分很难说清。加强这方面的研究可以更准确把握其作用机理，以便用于临床。2.优良菌种的选育。应选育出适应性强，遗传性状稳定，目的产物得率高的菌种。3.对发酵设备和发酵技术的改进。连续发酵设备和技术是沿用抗生素生产所用的设备，有许多需完善之处。4.采用现代化学分析手段，丰富质量鉴定内涵。
参考文献
徐锦堂.1997.中国药用真菌学.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社
张颖，沈业寿等.2001.液体发酵蜜环菌培养条件的优化及菌体多糖的分离.食用菌，23（2）：7
李平作，章克昌.2000.灵芝胞外生物活性多糖的pH控制发酵.微生物学通报，27（1）：5
乐超银，邵伟，邓春霞等.1999.灵芝液体发酵条件研究.生物学杂志,16（1）：17
孙东平，潘锋，史小丽.2000.灵芝发酵培养基的优化及灵芝胞外多糖的分离纯化.中草药，31（12）：941
汪维云，吴守一，朱金华.1999.灰树花液体深层培养工艺研究.生物工程学报,15（3）：378
宋爱荣，郭立忠，段方猛.1999.pH对灰树花液体深层发酵的影响.中国食用菌,18（3）：29
裘娟萍，孙培龙，朱家荣等.2001.灰树花深层发酵工艺条件的研究.微生物学通报,28（3）：33
裘娟萍，孙培龙，朱家荣等.2000.灰树花深层培养基的研究.微生物学通报,27（4）：275
雷德柱，高大维，于淑娟.2001.糖质溶液中发酵生产灰树花胞外多糖的研究.微生物学通报,28：（3）
谭周进，谢达平，李文革.1999.液体培养蜜环菌对炭源的利用试验.食用菌，（4）：7
王怡平，戴玲，沈业寿.2000.蜜环菌多糖的生物合成与发酵条件的相关性.生物学杂志,17（2）：13
邓百万，陈文强.云芝液体培养及富集硒研究.氨基酸和生物资源，2000，22（4）：21
葛克山，肖成军，郭渝培等.1999.云芝的悬浮培养及其浑浊汁的研究.中国农业大学学报,4（4）
冯永君，侯万秋.1998.金针菇FV088菌株液体培养工艺的研究.微生物学通报,25（5）：259
梁峙，吕文斌，张文林.2001.金针菇发酵培养液的富锌能力探讨.食用菌，（2）：7
刘士旺，梁宗琦，刘爱英.1998.羊肚菌液体培养研究初报.食用菌学报,5（3）：31
蒋丽，陈惠音，夏枫耿等.2001.深层发酵猴头菌的研究.基础研究,22（2）：23
刘少霞，陈立静，马慧等.2001.关于蛹虫草人工液体培养条件的研究.辽宁农业科学，（1）：44
赵文明，吴燕娜，李玉祥.2000.蛹虫草产胞外多糖的液体优化培养条件研究.中国食用菌,19（4）：30
杨淑全，澄澈.1998.冬虫夏草液体培养初报.中国食用菌,18（5）：28
陈石良，谷文英，陶文沂.2000.深层发酵灰树花菌株的诱变筛选.食用菌，（2）：7
李刚，杨凡，李瑞雪等.2001.原生质体紫外诱变选育灵芝新菌种的研究.微生物学通报,41（2）：229
李少萍，李萍.2001.天然发酵培养冬虫夏草中核苷类成分的含量及其变化.药学学报,36（6）：436
李平作，夏结红，章克昌.1999.灵芝深层发酵产物中四环三萜酸定性分析.中草药,30（8）：584
李刚.2000.发酵灵芝菌粉和灵芝子实体中灵芝多糖含量的比较.中国食用菌,19（1）：35
陆玲，潘欣，袁生.1999.金针菇液体培养菌丝与子实体SOD特性比较研究.中国食用菌,18（5）：26
杨晓彤，糜可，冯慧琴等.2000.不同云芝菌株及提取工艺所得结合蛋白多糖的分析比较.中国医药工业杂志,31（12）：545
