雷德柱1　于淑娟2

1　广州大学生物与化学工程学院，广州　510405；*2　华南理工大学食品与生物工程学院，广州　510640

　　真菌深层发酵过程中，菌丝球的形态对其生产能力具有显著的影响。最近，国外文献报道了菌丝球形态特征的自动成像分析，菌丝球形态对其生产能力的影响［1－5］和不同水平上各种因素影响菌丝球形态及其生产能力的相应数学模型［1，3－5］。国内在这方面的研究很少，且关于菌丝球形态结构与发酵过程的研究常常是分开进行的。笔者对发酵过程中灰树花菌丝球的形态结构及其与发酵过程的关系进行了研究。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　菌种　灰树花(Grifola frondosa)菌株GIM5.64，购自广东省微生物研究所。

　　1.1.2　试剂　乙醇、冰醋酸、福尔马林和二甲苯均为分析纯，广州化学试剂厂产品；切片专用石蜡，上海三精工贸有限公司产品。

　　1.1.3　主要设备　电热恒温箱，广州医疗器械厂产品；AO82型石蜡切片机，美国LKB公司产品；Leica MPS 30光学显微镜，德国Leica公司产品。

　　1.2　方法

　　1.2.1　培养条件　参阅文献［6］。

　　1.2.2　石蜡切片与光学显微镜观察　分别取深层培养1－8d的灰树花菌丝球，FAA固定液固定，石蜡切片，切片厚8－10μm，番红固绿染色，光学显微镜下观察菌丝球的内部结构［7］。

　　1.2.3　菌丝球和菌丝球核直径的测量　随机取30个带有营养液的菌丝球，排成直线，测量各菌丝球的直径，取其平均值；随机取与上述菌丝球培养时间相同的30个菌丝球，经石蜡切片后测量菌丝球核直径，取其平均值。

　　　　2　结果

　　2.1　迟滞期菌丝球的形态

　　灰树花深层发酵所用种子为对数生长后期的菌丝球，这种菌丝球的直径较小，约2mm，菌丝球周围的菌丝较长，占菌丝球直径的2/3以上。圆形的、发育比较充分的菌丝球，其中央有一个明显的核，核内菌丝染色较深，说明菌丝的生活力较强（图1）。有的菌丝球形状不规则，核并不象前者那么明显。

　　2.2　对数生长期菌丝球的形态

　　培养48h后形成的新菌丝球如图2所示。这些菌丝球形状不规则，菌丝排列相对松散、舒展。它们是菌丝球经过迟滞期后进入快速生长期的标志。

　　WX(20。2JZ(图1　培养过程中菌丝球和核的平均直径　Fig. 1 Mean diameters of the mycelial pellets and　their nuclei during the subm erged cultureJZ(图2发酵过程中核直径占菌丝球直径的百分比　Fig. 2　The ratio of the nucleus diameter to the　mycelial pellet diameter during the　submerged cultureWX)

　　Cox PW等研究黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC11414的深层发酵时发现，由迟滞期转入快速生长期时，菌丝球及其核的形状具有高度不均一性，在随后的发酵过程中，又变得较为均匀［2］。笔者对灰树花深层发酵菌丝球形态进行研究时发现，对数生长期，菌丝球及其核的形状不均匀，质地也不均匀。菌丝球核可以分为两部分，位于核中心、着色稍浅的部分为内核部分，着色较深的为外核部分。这说明种子菌丝球转入发酵培养基中培养时，菌丝球核外部分的菌丝首先获得较优越的生长条件，生长较快，形成的新菌丝着色较深，菌丝球内核部分的菌丝虽然也开始生长，但明显比核外部分的菌丝慢了一步。

　　培养60h后，菌丝球的核及其周围菌丝的情况如图3所示。这时，核内菌丝的着色较深，且较均匀，内核部分和外核部分的界限开始消失。这说明底物及溶氧已经充分扩散到核内部，核内菌丝的生长比较一致，内核部分不再受营养成分及溶氧的限制，这与Cox PW等人的观察结果比较相符［2］。

　　培养72h和84h后，核周围部分的菌丝生长旺盛，菌丝长度和密度都增加，着色仍然较深(图4)。但是，与前一阶段不同的是，核在菌丝球中所占的体积比明显下降，菌丝球表面的菌丝生长速度很快。

　　培养96h后，菌丝球的显著特点就是菌丝球周围菌丝的长度相对变短，核在菌丝球中所占体积比增大，核内重新出现着色不均匀的现象(图5)。这说明菌丝球直径和核的直径增大后，底物及溶氧的传递又受到限制，导致内核部分的菌丝生长速度放慢。这并不完全是因为菌丝的生长速度减慢，部分原因可能是因为菌丝的弹性降低，变得易于断裂。摇瓶或搅拌所产生的剪切力使得菌丝从菌丝球表面脱落，导致菌丝变短，核在菌丝球中所占体积比增大。这时，在发酵液中可以看到较多的松散菌丝，从而间接证明了上述观点。

　　Cui YQ等认为，菌丝球损伤包括破碎和刮切（即较老化的菌丝自身弹性下降，在搅拌的机械力作用下容易发生断裂，由于菌丝球为圆形，故形象地谓之“刮切”）两种情况。破碎后的菌丝球碎片重新生长为小菌丝球，而刮切作用形成具有较短菌毛的菌丝球和散落的松散菌丝［5］。

　　Nielsen J(1995)认为，在搅拌容器中菌丝球的破碎与能量输入呈线性相关，甚至在能量输入较低的情况下仍然有明显的破碎现象发生［1］。灰树花深层发酵的实际情况并非完全如此，因为菌丝球的破损碎片在发酵液中并不常见，但是可以观察到菌丝球上菌毛长短的变化和松散的菌丝。也就是说，在摇瓶培养中刮切机制占主导地位。经过刮切的菌丝球继续生长，而松散菌丝或经过缠绕形成菌丝球，或以松散菌丝形式生长。菌丝老化后，生长速度跟不上刮切速度时，菌丝球直径不再增加。

　　2.3　平衡期菌丝球的形态

　　培养120h后，菌丝球中央的核所占的体积比进一步加大，内核部分菌丝着色变浅，外核部分的菌丝着色深浅不一(图6)。这时，不仅内核部分的菌丝受到底物及溶氧限制，外核部分的营养和氧气供应也开始跟不上菌丝生长的需要，这或许是因为发酵液中代谢产物开始积累，发酵液的pH值发生较大变化，从而抑制了菌丝的生长。这一阶段菌丝的生长速度放慢，主要特点是代谢产物的积累。

　　培养144h后，菌丝球核内外两层结构之间的界限开始变得模糊。这说明菌丝球的生长已经进入平衡中期（图7）。这一时期，生物量趋于稳定，胞外多糖产量达到高峰。根据Cui Y Q等人的菌丝球损伤机制模型，菌丝球分为三个区：外层菌毛区、中间活跃区和内层饥饿区［4］。菌毛区向外生长；中间活跃区的深度取决于菌丝球密度、生长速率和发酵液中的溶氧压；而饥饿区中溶氧压不足，菌丝自溶。从切片中观察到上述三个区中的中间活跃区和饥饿区合而为一，说明此时溶氧压的限制使中间活跃区的活动减弱，但还不至于使饥饿区的菌丝产生自溶。

　　培养156h和168h后的菌丝球，不仅内核部分和外核部分的界限消失，整个核着色很浅，菌毛区的菌丝很短（图8）。这说明菌丝球外表的菌丝大部分已经脱落，这是菌丝生长进入平衡后期的形态标志。

　　2.4　衰老期菌丝球的形态

　　培养172h后的菌丝球，其主要特点是表面菌丝几乎全部脱落，菌丝球光滑；核开始解体，核中出现许多较大的空腔。这说明菌丝球已经老化，菌丝部分自溶。

　　2.5　发酵过程中菌丝球直径的变化

　　在整个发酵过程中，菌丝球直径的变化以及菌丝球核占菌丝球直径百分比的变化情况如图9和图10所示。

　　从这两项指标基本上能够判断出菌丝球生长的几个时期：第1－2天，种子菌丝球直径和核直径经过刮切后下降，开始形成新的菌丝球，为迟滞期；第2－4天，菌丝球和核直径逐渐增大，为线性生长期，这一时期菌丝生长最快，生物量迅速增加；第5天菌丝球直径趋于稳定，核直径继续增加，菌丝由线性生长期向平衡期过度，这一时期生物量的增长速度减慢，而胞外多糖产量迅速增加；第6天，菌丝生长进入平衡中期，这一时期，生物量趋于稳定，胞外多糖产量达到高峰。由菌丝球切片可知，第7天和第8天，菌丝球已经老化，开始自溶，生物量趋于下降，菌丝生长进入衰老期。

　　3　讨论

　　有关文献曾报道了底物和溶氧压限制与菌丝细胞生长和分化的关系，认为充足的底物及溶氧压可促进菌丝细胞生长，而底物与溶氧压的限制则诱导菌丝细胞分化，分化的菌丝细胞主要积累代谢产物［8，9］。因此，一般发酵过程中，早期要促进细胞生长，而线性生长期后则应控制其生长速度，促使细胞分化，从而积累代谢产物。本研究中，灰树花菌丝球在线性生长期后生长速度减慢，这有利于菌丝分化和胞外多糖的积累（图11）。

　　Becker P(1995)［10］和Defren K(1993)［11］描述了隆纹黑蛋巢菌(Cya thus striatus)菌丝球的生长模式：小的菌丝球形成生长区，得到充足的氧和营养供应，随着其体积的增大，传递到中心的氧受到限制，在氧限制区域诱导细胞分化并形成胞外多糖。由于菌丝球直径超过一定大小后就会产生氧限制，在无氧条件下会形成

　　图11培养过程多糖的积累　Fig. 11 Accumul ation of polysaccharides　during the submerged cutureWX)　WT乙醇，而较长时间的氧限制会导致菌丝球自溶。灰树花在所有已经研究过的食用菌中需氧量最大［12］，发酵后期，培养基中溶解氧受到限制时，更容易发生自溶。

　　培养基营养不足、pH降低、产物积累、流变学性质和溶氧压都会影响发酵环境，从而影响菌丝球的形态。营养物质和氧扩散的限制导致菌丝生长仅限于近菌丝球表面的区域，2氧饥饿导致直径大的菌丝球中空核的形成［13，14］。菌丝球大小和形态的控制对防止菌丝球内部的传递限制非常重要。维持产黄青霉(Penicillium chrysogenum)生长发育的菌丝球直径上限为400μm［15］。

　　Welssels JGH(1988)和BartnickiGarcias(1968)报道，1，3β葡聚糖酶可以在丝状真菌菌丝的顶端生长中参与细胞壁的形成，它可以催化1，3β葡聚糖的合成和降解这对可逆反应［8，9］。Stahmann K等发现，丝状真菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)可产生4种1，3β葡聚糖酶（GluⅠ、GluⅡ、GluⅢ、GluⅣ），生长在葡萄糖为唯一碳源的培养基中时，培养基上清液中只出现GluⅢ。当培养基中的葡萄糖耗尽后，真菌的胞外多糖即被降解为碳源。在这一生长时期，其它三种酶也出现，而且所有四种酶的活性都增加［16］。

　　由此可以假设，当发酵进入平衡后期，底物几乎耗尽，菌丝开始自溶，生物量开始下降。这时菌丝细胞开始利用已经合成的胞外多糖作为碳源来维持生命活动，从而导致胞外多糖产量也开始下降。根据有关文献的报道和笔者的研究结果，为了最大限度地获得灰树花胞外多糖，从形态上来看，应该在菌丝球开始自溶之前结束发酵；从菌丝积累胞外多糖来看，2应该在多糖积累达到高峰，且已经产生的胞外多糖还没有被菌丝中的β葡聚糖酶降解成可被利用的单糖、从而导致菌丝的第二次生长之前结束发酵。把这两者有机结合起来就能较好地控制发酵周期。

　　参考文献

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