日引1号杏鲍菇液体制种条件研究
黎勇 薛林浩 王丹
（内江师范学院生命科学学院；四川省特色农业资源研究与利用高校重点试验室，四川内江 641112）《食用菌》2012.3
摘要 通过用不同碳氮源组合的液体培养基培养日引1号杏鲍菇菌丝球和不同菌龄的一级菌种在相同条件下对其进行液体培养试验，以菌丝体的生物量和菌丝球直径大小为指标，初步确定杏鲍菇（日引1号）的液体制种条件。培养温度为27℃，转速为140r/min，培养时间为5d的条件下，试验对比在用马铃薯，麦芽糖，蛋白胨和黄豆粉，葡萄糖，豆饼粉以及小米粉，蔗糖，豆饼粉这三种碳氮源组合的培养基培养出的菌丝体的生物量和菌丝球直径大小，得出较为适合的碳氮组合的培养基为小米粉2%，豆饼粉2%，蔗糖2%，酵母膏2%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，VB15mg。而用于接种的接种菌块的菌龄宜小不宜大。
关键词 杏鲍菇（JIS-1） 液体菌种 菌丝
杏鲍菇（Pleurotus eryngii），又名刺芹侧耳。杏鲍菇子实体单生或群生，菌肉厚，开伞比较慢，柄组织细密结实，雪白粗壮，孢子少，保鲜期长，质地脆嫩、风味独特，有特殊的杏仁香味和鲍鱼口感，素有“平菇王”、“干贝菇”、“草原上的牛肝菌”之称，其栽培条件苛刻，适于工厂化栽培[1]。
日引1号系漳州市农业科学研究所于2001年2月从日本引进的杏鲍菇子实体经组织分离获得杏鲍菇新品种。其朵型大，丰产性好，品质较优，抗病性较强，于2010年2月25日通过福建省农作物品种审定委员会认定[2]。
杏鲍菇是适合于工厂化栽培的珍稀食用菌品种，但目前栽培生产多数是采用固体菌种，不利于杏鲍菇生产的规模化和机械化，而液体菌种的生产制种周期短，并且采用液体菌种栽培的杏鲍菇的出菇周期天数比固体菌种的短而产量则比固体菌种的高[3]，所以液体菌种在杏鲍菇栽培上有很好的应用效果，有利于杏鲍菇栽培生产的工厂化和现代化。日引1号杏鲍菇液体制种条件的探索目前仍未见报告。研究可以为日引1号杏鲍菇液体菌种的推广应用和工厂化生产杏鲍菇打下良好的基础，很有研究价值和经济意义[1]，[2]，[4]，[5]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株 杏鲍菇菌株（日引1号，由福建农业大学友情提供，内江师范学院特色农业资源研究与利用重点试验室栽培后制种）。
1.1.2 培养基 ① 改良PDA培养基：马铃薯（去皮）200g，葡糖糖20g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，水1000mL，琼脂15g。② 供试液体培养基，参考郭团玉、袁建平等，略有改良[6]-[11]。
a.马铃薯20%，麦芽糖2%，蛋白胨2%，酵母膏2%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，VB1 5mg[9]，[11]
b.小米粉2%，蔗糖2%，豆饼粉2%，酵母膏2%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，VB1 5mg[11]
c.黄豆粉2%，葡萄糖2%，豆饼粉2%，酵母膏2%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，VB1 5mg[10]，[11]，[17]
1.2 试验方法
1.2.1 菌种制备 按照1.1.2培养基的配方，配制改良PDA培养基于250mL的锥形瓶中，每瓶120mL，用棉花塞报纸盖好锥形瓶，将其放入高压灭菌锅中115℃灭菌20min，备用。于超净工作台上，制作好平板后从斜面试管中接种活化培养2周后，以孔法（D=8mm）转接于新平板上，恒温箱中27℃下静置培养14d备用[7]，[9]。
1.2.2 供试培养基的选择 菌种静置培养14d左右，待其长满液体表面时即供试液体培养基熬制好备用。具体方法为：马铃薯，小米粉和豆饼粉，黄豆粉和豆饼粉都要先用天平分别称量好，先熬成汁，并用5层纱布过滤去掉沉淀物，然后再将称量好的其余药品分别依次加入汁中熬制5min左右，并分别转入250mL的锥形瓶中，每瓶锥形瓶中倒入培养基100mL备用。
最后再将静置培养好的平板以打孔法取得菌种，转入锥形瓶内，置于27℃，140r/min条件下培养。每种供试培养基设置5个重复样。比较菌丝生成量与直径，确定最佳培养基。
1.2.3 不同菌龄菌种对杏鲍菇菌丝球生长的影响 将静置培养14d（长满平板2/3），21d（长满平板，开始爬壁）和40d菌龄菌种分别接种到装有小米粉液体培养基的锥形瓶中，27℃，140r/min条件培养。分别设5个重复样。
1.2.4 不同转速对杏鲍菇菌丝球的影响 将在小米粉培养基中培养出的菌丝球按10%的接种量接种到盛有90mL小米粉培养基的250mL的锥形瓶中，再将其放入摇床中培养。温度为27℃，转速分别为120r/min，140r/min，160r/min。每个转速设置5个重复样。
1.3 测量内容及方法
1.3.1 菌丝球生物量的测量 将锥形瓶中培养好的菌丝球用5层纱布过滤，收集菌丝球，并用蒸馏水反复冲洗，然后将收集到的菌丝球在60℃的温度下鼓风干燥至恒重，再用分析天平称量。最后取其平均值[16]-[18]。
1.3.2 菌丝球直径的测量 菌丝球培养结束后，随机取十五个菌丝球，在培养皿中排成一排，培养皿下衬上坐标纸，再测量样本中全部菌丝球的直径。重复3次，取其平均值[15]。
2 结果与讨论
2.1 供试培养基的选择结果表1，表2所示结果可知，最佳液体培养基为小米粉2%，豆饼粉2%，蔗糖2%，酵母膏2%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，VB1 5mg。
表1 不同供试液体培养基日引1号菌丝球的生物量（g/100mL）
培养基 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 平均值
马铃薯培养基 0.403 0.411 0.507 0.513 0.487 0.464(±0.023)a
小米粉培养基 1.312 1.458 1.825 1.408 1.162 1.433(±0.110)c
黄豆粉培养基 0.810 1.093 0.911 0.979 0.897 0.938(±0.047)b
表2 不同供试液体培养基日引1号菌丝球直径（mm）
培养基 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 平均值
马铃薯培养基 1.5 1.6 1.8 1.7 1.7 1.6±0.05a
小米粉培养基 1.3 1.5 1.6 1.4 1.3 1.42±0.05a
黄豆粉培养基 1.4 1.6 1.4 1.3 1.5 1.44±0.06a
2.2 不同菌龄接种菌块对日引 1 号杏鲍菇菌丝生长影响
如表3及图1，图2中的结果所示，达到相同的生长生物量，菌龄最大的菌中培养菌丝球不仅所需时间要比菌龄小的菌种的时间长6d，而且其生成的菌丝球要比菌龄小的菌种培养生成的菌丝球直径大得多，同时长菌龄培养得到的菌丝球其颜色加深已经呈现老化现象。所以使用菌龄短的菌种培养液体菌种，因为其菌龄短，生物活性强，能快速培养出直径小的菌丝球，培养周期短。
表3 不同菌龄的菌种日引1号菌丝球达标生物量和培养天数
菌种 菌丝球的平均生物量/(g·100mL-1) 培养天数/d
40d菌龄 1.456±0.070 10
21d菌龄 1.356±0.067 9
14d菌龄 1.433±0.110 4
2.3 不同转速对日引1号菌丝球的影响 不同转速对菌丝球的影响结果如图3和图4所示。转速为120r/min时的菌丝球生物量最低，直径最大，而140r/min时菌丝球生物量最高，菌丝球直径与转速为160r/min时的菌丝球直径相差不大，只是比160r/min时的菌丝球大0.03mm。随着转速的升高，培养基里面的溶氧量增加有利于菌丝球的生长，但转速超过一定范围时，由于液体转动时的剪切力过大，其对菌丝球的机械刺激不利于菌丝球的生成[8]，[13]。
3 结论
液体培养基的碳氮源组合的不同对杏鲍菇菌丝球的生物量、菌丝球直径的影响较大。从对菌丝球的直径这一重要指标来看，马铃薯液体培养基培养的菌丝球的直径却比小米粉培养基和黄豆粉培养基的大得多，菌丝球的生物量反而最小。黄豆粉液体培养基的菌丝球直径和小米粉液体培养基的相差很小，但菌丝球的生物量也比小米粉液体培养基培养所得的菌丝球生物量小。因此对日引1号杏鲍菇最佳液体培养基为：小米粉2%，蔗糖2%，豆饼粉2%，酵母膏2%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，VB1 5mg的培养基。
图1 40d菌龄菌种培养出的菌丝球
图2 14d菌龄菌种培养出的菌丝球
图3 不同转速对菌丝球生物量的影响
图4 不同转速对菌丝球直径的影响
菌龄对日引1号液体培养菌丝球的影响很大，菌龄短的接种菌块的接种优于菌龄长的种块，较小的接种菌块菌丝生长势强旺，菌丝体较之菌龄长的接种菌块疏松，比菌龄长的接种菌块更易受到液体转动时所产生的剪切力的机械切割，所以用其所培养出的菌丝球直径明显比较老化的接种菌块小。培养出液体菌种的时间也比较老化的菌种短得多。试验表明，在培养杏鲍菇液体菌种时，以使用14d菌龄的菌种为宜。
综合考虑对日引1号杏鲍菇菌丝球的生物量和直径影响，振荡培养最适转速为140r/min。
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