食用菌染菌菌包微生物分析
一、实验目的
1、学会微生物实验的基本操作方法；
2、了解微生物分离和纯化的原理，掌握常用的分离纯化微生物的方法；
3、掌握观察菌落形态特征的方法；
4、建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节。
5、掌握微生物有关的染色方法。
6、了解光学显微镜构造和原理，掌握正确使用显微镜的方法。
7、掌握对菌落计数的基本方法。
二、实验原理
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂抑制其他微生物生长，从而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板，然后多次平板划线分离出纯菌落，结合显微镜检测个体形态特征，确定是否得到纯菌落。选择培养基，由于所含成分的差异，只适合特定的微生物的生长，从而可以分离不同微生物，具体如下表：
适合生长细菌 培养基
细菌 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
放线菌 高氏I号培养基
酵母菌 马丁氏琼脂培养基
霉菌 PDA培养基+链霉素
革兰氏染色法的原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
三、实验材料
1、培养基和菌种：高氏I号培养基，NA培养基，马丁氏琼脂培养基，孟加拉红培养基，被污染食用菌菌包。
2、溶液和试剂
配制各培养基所需药品，10%酚液，1%链霉素溶液，75%和95%酒精溶液，草酸铵结晶紫，碘液，0.5%沙黄染液，香柏油。
3、仪器或其它用具
分析天平，1000ml烧杯，玻璃棒，250ml锥形瓶，培养皿，玻璃涂棒，酒精灯，火柴，移液枪、显微镜，玻璃珠，镊子，无菌水，载玻片，吸水纸。
四、实验步骤
具体流程：制备培养基→倒平板→制备梯度稀释液→涂布→培养→挑单菌落→继续培养纯化→保存菌种→单染色和革兰氏染色→计数
1、制备培养基
1.1 高氏I号培养基（放线菌）
可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、氯化钠0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂15-20g、水1000ml。
先把淀粉放在烧杯里，用50毫升水调成糊状后，倒入950毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.4～7.6，分装于锥形瓶中，加胶塞后，121℃高压灭菌30min。
1.2 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（细菌）
牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15-20g、水1000毫升
在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘底。用氢氧化钠溶液调整pH值到7.2～7.4,分装在各个锥形瓶里，加胶塞，121℃高压灭菌30min。
1.3 马丁氏琼脂培养基（酵母）
磷酸二氢钾1g、七水合硫酸镁0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂15—20g、水1000ml、pH自然。
在烧杯内加水100毫升，并将各成分依次加入水中。待各成分完全溶化后，再将孟加拉红配成1%的溶液，在培养液中加入1%的孟加拉红溶液3.3ml，混匀后，加入琼脂加热溶化，等琼脂完全溶解补足水分到所需体积。分装于锥形瓶里，加上棉花塞后，121℃高压灭菌30min。注意：临用时每100ml培养基中加1%链霉素液0.3ml。
1.4 PDA培养基+链霉素（霉菌）
马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15～20g,蒸馏水1000ml，配置好后分装在锥形瓶中，再加胶塞，最后121℃高压灭菌30min。
将镊子，带有玻璃珠的蒸馏水，竹签，平板，研钵。121℃高压灭菌30min。
2、倒平板
将配好的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、PDA培养基+链霉素、高氏I号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化待冷至55～60℃时，高氏I号琼脂培养基中加入10%酚数滴，马丁氏培养中，每100ml培养基加入1%链霉素溶液0.3ml，混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
3.制备稀释液
称取30g污染后的食用菌菌包，用研钵研碎，放入盛270ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使粉末与水充分混合，将细胞分散。用一支lml移液枪从中吸取1ml悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后再用1ml的移液枪从此试管中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的稀释液溶液
4、涂布接种
用移液枪分别吸取10-4、10-5和10-6的稀释液溶液分别加入到不同培养基的平板上（每种培养基不同梯度做三个重复，霉菌编号为M-4，M-5，M-6；细菌编号为B-4，B-5，B-6；放线菌编号为F-4，F-5，F-6；酵母编号为Y-4，Y-5，Y-6），各吸取0.1ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。
用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。
5、恒温培养
将接种好培养基平板置于不同条件下恒温培养，具体如下表：
培养基 培养条件
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（细菌） 倒置，37℃恒温
高氏I号培养基（放线菌） 35℃恒温
马丁氏琼脂培养基（酵母） 正放，28-30℃恒温
PDA培养基+链霉素（霉菌） 28℃恒温，
6、观察并挑菌落
将培养后长出的单个菌落根据其大小、颜色、形状等特征进行观察，之后根据菌落不同特征分别挑取少许菌体接种到上述培养基的平板，分别置28℃和37℃温室培养。若发现有杂菌，需再一次纯化，直到获得四种微生物的纯菌体。
7、单染色
染色剂对涂片进行染色，简便易行，适于进行微生物的形态观察。在一般情况下，细菌菌体多带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。因此，常用碱性染料进行单染色，如美兰、孔雀绿、碱性复红、结晶紫和中性红等。若使用酸性染料，多用刚果红、伊红、藻红和酸性品红等。使用酸性染料时，必须降低染液的PH值，使其呈现强酸性（低于细菌菌体等电点），让菌体带正电荷，才易于被酸性染料染色。单染色一般要经过涂片、固定、染色、水洗和干燥五个步骤。
用草酸铵结晶染色具有染色迅速，着色深，菌体呈紫色的特点。
①、涂片固定。
②、草酸铵结晶紫染1分钟。
③、自来水冲洗。
④、干燥
⑤、镜检
关键步骤及注意事项 1.涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀， 2.水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。
8、革兰氏染色
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
①、涂片固定。
②、草酸铵结晶紫染1分钟。
③、自来水冲洗。
④、加碘液覆盖涂面染1分钟。
⑤、水洗，用吸水纸吸去水分。
⑥、加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。
⑦、沙黄（稀）染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。
染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。
9、记录实验
待鉴别的微生物 菌体颜色 菌体形态 G+,G-
10、计数
挑取一定数量的纯菌体，放入盛10ml无菌水的大试管中，振摇混匀，使菌体与水充分混合，将细胞分散。用一支lml移液枪从中吸取1ml悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后再用1ml的移液枪从此试管中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的稀释液溶液，用10-3、10-4、10-5、10-6梯度的溶液涂布在平板上，观察实验结果，选择菌落比较分散且易于计数的平板，数出菌落数，在乘以稀释倍数，即为挑取的菌体的总数。
五、注意事项
1、利用超净台工作时，开始操作前要用75％酒精消毒手，如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。
2、在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯,以后一切操作，开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。
3、进行培养时，不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。
附：专业名词解释
1、菌落：微生物的单个个体或孢子在固体培养基上生长繁殖后形成肉眼可见的集团。
2、菌苔：几个菌落连在一起成片生长。不同的菌落、菌苔大小、形状、光泽、颜色、硬度、透明度不同，这些特征可供鉴定参考。
