2、分装

　　分装是将配制好的培养基分别装到特定的原种或栽培种使用的容器中，如菌种瓶、菌种袋。不论是装瓶还是装袋，都要求装得松紧适度，培养基上端距瓶(袋)口要有3厘米左右的距离，瓶(袋)口干净。

　　①、不同种型的分装

　　a、谷粒种。以谷粒作培养基时，谷粒装入瓶后，稍加摇动即可。谷粒不可装得过满，上端以距瓶口4厘米为佳，这样能更有效地减少培养期的污染。

　　b、木屑种、草料种和粪草种。这些种型的培养基分装时，要用力压实些，瓶的下部可稍松些。木屑、玉米芯粉、稻草粉、豆秸粉等，从外观上能看到颗粒间稍有微小缝隙为度，颗粒较大的碎稻草、碎麦秸，则要用力反复施压，以利日后菌丝的联结。压实后，在瓶(袋)中央从上至下打一洞(到底)，以增加培养基中的氧气，利于菌丝生长。　③木塞种。先装入木塞和木屑添充物的混合物，边装边摇，使其尽量装实，然后在表面加盖木屑添充物1厘米厚左右，并压平。

　　②、不同容器的分装　常用的原种和栽培种的容器有菌种瓶、废罐头瓶和聚丙烯折口塑料袋。生产者可以根据自己的经验和实际情况选择使用。

　　a、菌种瓶　菌种瓶也称蘑菇瓶，这是食用菌菌种生产用的专业容器，最适合食用菌菌丝的生长，最适于菌种的生产。其特点是口径大小适宜，利于通气，又不易污染。菌种瓶用无色透明玻璃制作，耐高温高压，容量’750毫升，口径3厘米左右。分装时，以使用漏斗效率最高，瓶口也干净，有利于减少污染。培养基不可装得过多，应装至瓶肩以下(图3—14)，若是谷粒种最好要低于瓶肩2厘米。这样，可减少培养期的污染。

　　b、废罐头瓶　废罐头瓶来源广泛，物美价廉，购买方便。其优点是分装快，透气性好，发菌快；缺点是扎口慢，污染率偏高。使用罐头瓶时，要用聚丙烯塑料薄膜双层封口，料装至瓶肩处即可。封口时注意切勿漏扎。

　　c、聚丙烯折口袋　折口袋比普通袋更易于码放，但折口袋的折角易于被摩擦而出现沙眼。因此，使用折口袋要格外注意折角处。生产原种的塑料袋不可过大，一般以15～17厘米宽，25～30厘米长，0．04～0．05毫米厚为宜，而且要使用套环和棉塞或套盖，以利通气(图3—15)。分装时，先将培养基装入，压平，然后套入套颈，打孑L，加塞或盖。为了节省工时，可购入能多次使用成套的套环和套盖(福建古田盛达食用菌经营部)。原种每袋重400～500克为宜。栽培种则可大一些，可使用17～18厘米宽，33～35厘米长的大袋。使用塑料袋作容器时，要注意配料和分装时去掉较尖锐的粗大颗粒物，如小木渣，以防扎破袋子。　无论使用哪种容器，装好料后，都要从中央打一孑L直至瓶(袋)底，以利菌丝生长。

　　3、灭菌

　　分装完毕后，要马上灭菌，不可隔夜，特别是在高温高湿季节，拌料和上锅最好在8小时内完成。这一时间间隔越短，灭菌效果越好。中丰富的养分和适宜的含水量，致使大量灭菌效果和日后菌种的生长。

　　不论使用高压锅灭菌还是自制常压锅灶灭菌，灭菌物品的排放都不可过于拥挤叠压，以免蒸汽穿透不均匀，灭菌不彻底。当使用较大的灭菌设备时，要使用铁筐或搁板，以利蒸汽

均匀流通，使灭菌物品受热均匀。

　　当低温季节使用玻璃瓶作容器时，切勿凉瓶进热锅，以防菌瓶炸裂。

　　①、高压蒸汽灭菌使用压力容器，首先要认真阅读使用说明，并严格按说明操作。高压灭菌的操作步骤应为：

　　A、装入灭菌物品，注意棉塞不可朝向锅壁，瓶子最好倒放，棉塞朝向锅门。棉塞朝上时，最好上盖一层牛皮纸，以防棉塞打湿。关闭锅门，拧紧螺杆。

　　B、将压力控制器的旋钮拧至套层，先将套层加热上压，当压力达到0．05兆帕时，打开排汽阀放汽。

　　C、当套层压力达到预置压力0．12兆帕，或0．14兆帕，或0．20兆帕时，将压力控制器的旋钮拧至消毒，使套层的蒸汽进入消毒室。从此开始计时。不同培养基材料，不同容量，灭菌时间不同。

　　谷粒：一次灭菌200瓶以下时，0．14兆帕需3～4小时，300～500瓶需4～5小时，500～800瓶需6～7小时。0．20兆帕200瓶以下需2．5～3．0小时，300～500瓶需4小时，500～800瓶需5小时。

　　木屑和草料：0．12兆帕200瓶以下时需1．5小时，300～500瓶需2．5小时。0．14兆帕200瓶以下需l小时，300～500瓶需2小时，500～800瓶需3小时，800瓶以上需4小时。

　　粪草：0．12兆帕200瓶以下需4小时，300～500瓶需5～3-3．5小时；500瓶以上最好使用0．14兆帕以上的压力；500-800瓶时，0．14兆帕需4～4．5小时，0．20兆帕需3小时。　

　　灭菌过程中如果出现压力和温度不符(指示温度过低)，表明锅内冷凝水排出不畅，应拧大冷凝水排出阀。

　　D、关闭热源或停止送汽。使压力和温度自然下降。灭菌完毕后切不可人工排汽降压，否则会造成瓶和袋的破裂。当压力降至0后，打开排汽阀，放净饱和蒸汽，放汽时要先慢排，后快排，最后再微开锅盖，让余热把棉塞吸附的水汽蒸发。

　　E、打开锅盖，取出灭菌物品，搬入预先消毒处理过的洁净的冷却室。

　　②、常压蒸汽灭菌　一般说来，常压蒸汽灭菌不适合灭菌需时较长的培养基，如谷粒和粪草。常压蒸汽灭菌常用来灭菌木屑种型和草料种型的培养基。容积大小不同，灭菌要求的时间也有不同，一般在8～15小时。常压蒸汽灭菌的操作步骤如下：

　　A、加水至足量。

　　B、将灭菌物品按层次码放，注意棉塞不可朝向四壁。灭菌物品也不可紧贴四壁，以利蒸汽流动。同时，在灭菌灶下部插好温度计。

　　C、关闭灶门，点火加温。为了缩短拌料与灭菌的时间，也可在码放灭菌物品前点火加温。火力要足，关闭灶门后，要在2小时内达到“圆汽”。“圆汽”即达到100℃。

　　D、“圆汽”，达到100℃后开始计时，600瓶以下的小锅，要维持100℃8小时，600 ~ 1 000瓶要维持100℃10--12小时。在此期间一是要注意经常观察温度，不可低于98℃，密闭性

能较好的锅灶可达到102～107℃；二是要注意不要烧干锅，没有预热水锅的要随时观察水位，有预热水锅的要经常观察预热水锅的水量，并及时加水。

　　E、达到灭菌时间后停止加热，让温度自然下降至锅顶不再有蒸汽上升，然后微开灶门，利用余热蒸发棉塞表面的水分，1～2个小时后打开灶门，取出灭菌物品搬人事先消毒处理过的洁净的冷却室。有条件的可再闷一夜，灭菌效果更好。

　　使用常压蒸汽灭菌锅灶要特别注意以下三点：

　　水量要足，以产生足够量的蒸汽。

　　灶体不可过于严密，以利锅内冷气的排出，蒸汽的流通，但也不可严重漏气，以利保温。

　　火力要足，以使蒸汽充足，能较快穿透灭菌物品。火力不足时，虽然锅里的水处于1 00℃，但产生的蒸汽量不够，培养基升温很快，按预定时间达不到预期的灭菌效果。火力要充足到锅顶蒸汽打旋，即“圆汽”。

　　4、冷却

　　规范化的专业菌种场，冷却室是高度无菌的。因此，从高压灭菌锅的出口取出的物品就直接置于了冷却室冷却，冷却室使用前需经洁净和消毒处理，操作人员进入冷却室要更衣、戴帽、换鞋。置于地面冷却时，要铺无菌布垫，以保持菌种瓶(袋)和铁筐表面高度无菌。

　　简易菌种场的冷却室也要尽量清洁无尘，并做好消毒处理。灭菌物品出锅时和搬运过程中尽量少接触非无菌物品。

　　冷却室的洁净程度和无菌程度对接种操作过程中的菌种污染起着重大作用。因此，在强化接种操作的无菌意识的同时，要切实做好冷却室的洁净和消毒处理。

　　5、接种

　　冷却至30℃左右应及时接种。因为在灭菌后与接种前之间的时间越长，菌种瓶(袋)表面被污染或沉落有灰尘的机率越高，造成接种操作的污染的可能性就越大。

　　接种的规范过程应是：清洁接种室一搬入接种物和被接种物一消毒一接种操作一搬出接种好的物品一接种室的清理、清洁和消毒。具体方法参考本章母种制作中的接种部分，这里仅具体介绍接种操作。

　　接种原种和栽培种的要求与母种接种相同。一支试管母种可以接原种4～5瓶，一瓶原种(750毫升)可以接栽培种40～60瓶。

　　原种和栽培种的接种，可二人操作，也可一人完成。当二人操作时，左边的人持待接种的原种瓶或栽培种瓶，负责开盖和盖盖；右边的人持试管母种或原种瓶和接种钩或接种勺(或大镊子)负责接种。一人接种时，可将试管母种或原种瓶置于固定架上，固定架的高度以试管口或原种瓶口正处于酒精灯火焰上方为准。左手移动被接种的原种瓶和栽培种瓶，并开盖、盖盖，右手持接种钩或接种勺取种接种。接种操作的全过程都在酒精火焰上方进行。需特别提起注意的是：

　　①、接种前要仔细检查　作为接种物的母种或原种是否状态良好。这主要从以下几个方面检查：一是菌龄，菌龄适宜的母种或原种，接种成原种或栽培种后，菌丝萌发快，生长快，长势旺，不易污染；二是菌种是否是纯培养，无污染。如果使用污染了的菌种转接，原种和栽培种则全部污染。检查试管母种是否有污染时，一要看菌落表面有无异色异物，二要对着光源看培养基底部和边缘有无明显的斑点，三要看棉塞有无霉菌。检查原种有无污染时，要整个种瓶全方位仔细观察，有杂菌污染过的原种总是出现异色，除明显的霉菌菌落外，多为黄色的拮抗线、拈抗斑。有任何疑虑的母种和原种都不可使用。　　　　　　

　　②、接种物表面　接种开始前要用酒精棉球擦拭，以除尘和消毒。

　　③、原种表面的老菌丝或菌膜及母种接种块要去除。

　　④、银耳母种每支试管只能接种原种1～2瓶，必须使用有耳基的部位，因为没有耳基部位银耳菌丝太少，香灰菌丝太多；银耳原种只能使用上层部分，因为越往下部银耳菌丝就越少，接种后出耳率低，影响产量。

　　⑤、母种转接原种时，应将母种块置于瓶中的洞口处，以利生长。

　　6、培养与检查

　　培养室使用前要认真做好清洁和消毒工作，清洁时要注意不要扬尘，有条件的菌种场要定期清洁和消毒。培养期间主要要做好两项工作，一是环境条件的调控，二是对菌种生长情况的检查，及时拣出劣杂个体。

　　①、环境条件的调控

　　不同种和品种的食用菌，菌丝体生长的适宜条件不同，这主要是温度、湿度、光线和通风。在实际生产中，要尽量使这些条件调整到最适，以满足食用菌生长的需要。

　　A、温度

　　食用菌耐高温性能较差，此外，高温还有利于霉菌的生长。所以，培养温度切勿过高，以培养物菌丝生长的最适温度或稍低于最适温度为宜。应注意瓶(袋)内培养基的温度较外部一般高2～3℃，培养室温度应控制在低于菌丝生长最适温度2～3℃。

　　培养过程中，随着菌种的生长，生物量增加，发酵热会日渐增加，高温季节要格外注意降温，低温季节要逐渐减少加温。

　　培养室的加温方法很多，如暖气加温、煤火加温、电热加温等，生产者可根据自己的经济和生产情况，选择适宜的加温方式。这里需要提醒生产者的是，采用煤火加温时，要安装烟囱或将炉灶放在培养室外，通过火墙加温，以避免一氧化碳对菌种生长的不良影响。

　　培养室的降温可采用空调降温、遮阳降温、通风降温、喷水降温等。采用空调降温时，风量不可过大，要求培养室的空气洁净度高，否则，易由空气尘埃的流动导致污染。采用遮阳降温时，可将培养室的屋顶搭架遮阳物，还可在朝阳面架起遮阳屏，也可在窗外挂草帘。喷水降温时要注意通风，以防霉菌滋生。

　　简易菌种场在高温季节可采用“近地稀养”的方法培养菌种，所谓“近地稀养”，就是将菌种置于地面和距地面较近的培养架上，菌种稀疏摆放，瓶(袋)间留有1～2厘米的空隙，以利散热。据测定，地面温度较地面以上1．5米高处温度低2～3℃。山区可在高海拔处制种，也可达到降温培养的效果。

　　B、大气相对湿度

同　培养室大气相对湿度最好控制在75％以下。有条件采取空调降温的培养室，降温的同时即可除湿，没有空调降温条件的，高湿季节要格外注意除湿。目前以通风和石灰吸附两大除湿方法为主。利用石灰吸附除湿时，要在培养前洒好石灰，以减少培养期菌种的搬动和培养室空气中的粉尘污染。石灰可撒于地面和培养架上。石灰一方面可以吸附空气中的水分，同时还是很好的消毒剂，利于菌种的无菌培养。低温高湿的梅雨季节，可采取加温排湿。

　　C、光线

　　食用菌菌丝生长不需要光，极个别品种仅需微弱的散射光。因此，培养室要尽量避光。特别是在培养后期，上部菌丝比较成熟，遇光后易形成原基。　④通风换气。食用菌是好气性真菌，菌丝生长需要充足的氧气。另外，菌丝在生长中，呼吸放出大量的二氧化碳和水。多数食用菌菌丝生长对二氧化碳不敏感，较高浓度的二氧化碳反而能促进菌丝的生长。因此，培养室的通风作用主要是增加氧气、排湿和调节温度。

　　②、检查

　　原种和栽培种在培养期间，要经常检查，以及时淘汰劣质菌种体和污染的个体。一般而言，原种接种后4～7天内行第一次检查，表面长满之前行第二次检查，菌种长至瓶肩下至瓶的l／2深度时行第三次检查，当多数菌种长至将近满时行第四次检查。经过这四次检查后一切都正常的原种才成为成品，方可包装人库。栽培种应在接种后长至料深I厘米左右行第一次检查，长至l／2～l／3深度行第二次检查，长满之前行第三次检查。检查主要是以下内容：

　　A、萌发是否正常　原种在进行第一次检查时进行。发现萌发缓慢或菌丝细弱者，及时拣出。要逐瓶(袋)检查，不可遗漏。

　　B、有无污染　在各次检查中，有无污染都需仔细检查，特别是原种尚未长满表面之前，要仔细观察，看是否有其他菌落的生长。有时，分解木质纤维素能力不强的杂菌侵染后，仅在培养基表面形成小小的菌落，经数日培养后，常被食用菌菌丝所盖没。在这种情况下，菌种长满后很难分辨。对于这类污染菌，早期的检查和发现格外重要。

　　C、活力和生长势　这贯穿于各次检查，菌种的活力和生长势主要表现在菌丝的粗细、浓密程度、洁白度、整齐度等。要及时拣出菌丝细弱、稀疏、苍白无力、边缘生长带不健壮、不整齐的个体。

　　在培养基适宜、灭菌彻底、培养环境条件合适的情况下，多数食用菌，如平菇、香菇、木耳、毛木耳、金针菇、双孢蘑菇、猴头、灰树花等，原种长满需4～6周。具体需时因品种、培养基、容器大小的不同而异。

　　(五)、优良菌种特征与鉴别

　　食用菌优良品种性状的鉴定需要生理、生化、栽培、抗逆性、抗杂力等多方面的鉴定，是选种育种工作必不可少的重要组成部分。作为菌种生产者对菌种的鉴别，不是指其使用品种的种性，而是在种性既定的前提下，对大量的扩繁后的菌种体生长状况的检查和优劣的鉴别。在使用品种种性优良，母种符合使用标准的前提下，原种和栽培种培养基适宜，灭菌彻底，接种操作规范，培养条件适宜，是完全可以生产出合格的原种和栽培种的。

　　不同种、不同品种，甚至不同培养基，原种与栽培种的外观不完全相同，外观特征只有在品种相同、培养基相同、培养条件相同的前提下，才有可比性。这里介绍的菌种鉴别及特征主要应用于菌种培养期间，因此，这也是个动态的过程。尽管不同品种、不同培养基、不同培养条件下菌种外观有所不同，但在生长过程中，仍有不少共性，以资鉴别。优良的原种和栽培种应具备如下特征：

　　1、生长整齐　同一品种，使用相同的培养基，在相同的条件下培养，长速和长相应基本相同。

　　2、长速正常　不同种、不同品种、不同培养基、不同生长条件长速不同，但是每一个品种，在固定的培养基和培养条件下，有其固定的长速。如美味侧耳原种，在纯棉籽壳培养基上，装干料125～130克，湿重300～320克，在恒温2512下培养，应在21～25天长满。

　　3、色泽正常　不同食用菌的母种虽然色泽略有差异，但在天然木质纤维质的培养基或谷粒培养基上生长时，几乎菌丝体都是白色。除草菇、银丝草菇外，几乎所有的食用菌正常的原种和栽培种外观均应纯白色。如果污染有其他真菌，从菌种外观可看到污染菌菌落的颜色，常污染食用菌菌种的菌落颜色有绿色、灰绿色、暗褐色、橘红色、灰白色、黑灰色等。有时污染菌的菌落被食用菌菌丝遮盖后，可出现明显可见的黄色或黄褐色的颉颃线。此外，整个菌种体上下不同部位还应色泽鲜亮一致。特别是当上部灰暗时，应拣出不用。如果整批出现上部灰暗苍白，色泽不鲜亮，应认真找原因，整批菌种销毁不用，重新制种。

　　4、菌丝丰满　优良的原种和栽培种，菌丝丰满、浓密、均匀。如果菌丝干瘪，菌体上部萎缩，则不可使用，应认真分析原因，重新制作。

　　5、菇香味浓郁　正常的原种和栽培种，打开瓶(袋)盖，可闻到浓郁的菇香味，如果气味清淡或无香味，说明菌种有问题，不能使用。

　　(六)、主要食用菌原种和栽培种特征

　　1、双孢蘑菇

　　双孢蘑菇常用发酵过的粪草或谷粒作原种栽培种的培养基。在粪草培养基上，菌丝洁白至苍白色，粗细均匀，后期出现菌索，上下均匀一致，无扇形变异，无菌被，在23℃恒温培养条件下，原种750毫升菌种瓶25～30天长满瓶，栽培种要早5天左右满瓶。谷粒种菌丝浓白粗壮，遇高温时微黄，上下均匀一致。如果生长中就有菌被形成，说明过湿，如果生长不均匀，表明浸泡和预煮时间不够。若生长中菌丝渐变黄，表明培养温度过高，要多方采取降温措施。在高温条件下(超过23℃)培养的菌种，使用时不易吃料，发菌慢。

　　2．香菇

　　香菇菌丝洁白、舒展、均匀，生长边缘整齐，不易产生菌被。在常规木屑麦麸培养基上，在25℃恒温培养，750毫升菌种瓶，原种一般40～45天长满，在加有一定比例的玉米粉的木屑培养基上，菌丝更加浓密、洁白，生长期可缩短3天左右。在相对加富的各种培养基上，气生菌丝都有不同程度的增加。在较高的培养温度(30℃或更高)下，培养基中的菌丝稀疏，生长边缘可见的丝状不明显。在高温条件下，培养基表面易出现分泌物，这些分泌物常由无色透明渐变为黄色至褐色，其色泽的深浅与品种有关。一般而言，起源于日本的品种色素较浅，中国种则色素较深。香菇菌种在有光和低温刺激下，常在表面或贴壁处有菌丝聚集的头状物出现，这是短周期品种和易出菇的标志。生长良好的原种和栽培种有浓郁的香菇味。

　　3、木耳

　　菌丝洁白、浓密、粗壮，生长边缘整齐有力，菌丝粗细均匀整齐，上下一致。菌丝长满瓶后出现浅黄色水珠。长满瓶后在有光条件下出现胶质的耳基。如果菌丝出现不均匀的长势，木塞种出现斑块状或扇形生长，表明有细菌污染。

　　4、平菇

　　菌丝洁白、浓密、粗壮、鲜嫩，菌丝生长边缘整齐，比上述三种菌丝都粗壮而浓密。多数品种在培养基上方表面形成绒毛状气生菌丝，低温品种的气生菌丝常分泌黄色或黄褐色色素，特别是在高温季节，低温品种常出现“黄梢”，分泌黄色至黄褐色水珠，这都属正常现象。

　　如果菌种体上部菌丝稀疏、灰暗、无力、干瘪，而下部或生长边缘正常，表明培养温度过高、湿度过大、通风不良，或有大量细菌生长。如果菌种体表面出现白粉状物，表明培养温度过高。在较晚发生毛霉污染时，平菇菌丝常能将毛霉菌丝遮盖，不经仔细观察，很难发现污染。没有菌种生产经验的人常把其作为正常菌种使用。在这种情况下仔细观察，可发现菌丝分布较乱，且色泽较暗或稍黄，菌丝也显更密集。完成培养后．在25℃以下，多数品种易在上表面形成子实体原基。

　　5、草菇

　　草菇菌丝灰白至灰黄色，透明或半透明，有光泽，粗壮但稀疏而蓬松。生长均匀，几日后便有红褐色至锈红色厚垣孢子产生。厚垣孢子初灰白色，渐色泽加深，直至红褐色或锈红色。在稻草、棉籽壳或废棉培养基上，一般14～18天长满瓶。满瓶后3～5天使用效果最好。

　　6、灵芝

　　菌丝浓密而洁白，短健整齐，生长均匀。表面易形成坚韧的菌被，菌被初白色，后渐变为黄色。在棉籽壳培养基上，在27～29℃下培养，原种25天左右长满瓶，栽培种18～20天满瓶。

　　7、鸡腿菇

　　菌丝浓密、洁白、粗壮，生长边缘整齐有力，在草料培养基上，在25℃恒温条件下培养，原种30～35天长满瓶(。750毫升)，栽培种25～30天长满。

　　8、阿魏侧耳

　　菌丝浓密、洁白、粗壮，上下均匀一致，生长整齐，外观酷似平菇。生长较慢，在25℃恒温条件下培养，原种45～50天长满瓶(750毫升)。

　　9、鲍鱼菇和盖囊菇

　　菌丝洁白、浓密、粗壮，生长均匀整齐，表面有黑色分生孢子团。

　　(七)、常见问题的分析和处理

　　就一般情况而言，在品种优良，母种生长良好，培养基适宜，灭菌彻底，接种操作规范，培养条件适合的条件下，就能够生产出优良的原种和栽培种。然而在生产实践中，也常出现一些意想不到的问题，影响菌种生产的如期完成。归纳起来，常出现的问题及处理如下：

　　1、接种物萌发不正常　主要表现为两种情况：一是不萌发或萌发缓慢；二是萌发出的菌丝纤细无力，扩展缓慢。

　　这首先要检查培养温度是否适宜，培养温度过高常造成此类问题的发生。如果培养温度适宜，要检查培养料的含水量是否过低。培养料含水量严重不足时，极易造成接种物不萌发。

　　如果含水量也适宜，就应从母种和培养基原料及灭菌效果上查找原因。总结上述，分析的思路应为：培养温度一培养基含水量一培养基原料质量一灭菌规程及效果一母种。对于接种物不萌发，或萌发缓慢，或扩展缓慢来说，这几个方面的因素必有其一，甚至可能是多因子的不良影响。

　　①、培养温度过高　造成接种物不萌发、萌发迟缓、生长迟缓。

　　②、含水量过低　尽管拌料时加水量充足，但由于拌料不均匀，造成培养基含水量的差异，含水量过低的菌种瓶(袋)接种物常干枯而死。发生这种情况，及早补水尚可挽救。

　　③、培养基原料霉变　正处霉变期的原料中有大量有害物质，这些物质耐热性极强，在高温下不易分解变性，甚至在高压高温灭菌后仍保留其毒性。接种后，菌种不萌发。这一因素的确定，需将培养基和已接种的种块取出，分别置于PDA培养基斜面上，于适宜温度下培养，不见任何杂菌长出，而种块则可萌发、生长。

　　④、灭菌不彻底　出现这一问题的灭菌不彻底，主要是培养基内留有大量细菌，而不是真菌。培养基中残留和继续繁殖增加的细菌，多数情况下无肉眼可见的菌落，有时在含水量过大的瓶(袋)壁上，在培养基的颗粒间可见到灰白色的茵膜。这一原因可通过培养基的分离培养得到证实。

　　造成灭菌不彻底的原因有很多，将在下文有关污染问题分析中讨论。

　　⑤、母种菌龄过长　菌种生产者应使用菌龄适当的母种，多种食用菌母种使用最佳菌龄都在长满斜面后1～5天。在计划周密的情况下，母种和原种生产的紧密衔接是完全可行的。

　　若母种长满斜面后一周内不能使用，要及早置于4～6℃下保存。

　　2、发菌不良　发菌不良的表现多种多样，常见的有生长缓慢。生长过快但菌丝纤细稀疏，生长不均匀，菌丝不饱满，色泽灰暗等。造成发菌不良的原因主要有：

　　①、培养基酸碱度不适。可将发菌不良的菌种瓶(袋)的培养基挖出，用pH试纸测试。

　　②、原料中混有毒害物质，如松、杉、柏、樟、桉等树种的木屑，原料有过霉变，有霉菌毒素。

　　③、灭菌不彻底，培养基中生长有肉眼看不见的细菌。

　　④、装料过紧，水分过少，透气性过差。

　　⑤、培养室温度和湿度过高，空气流通交换不够。

　　⑥、培养基含水量过大，装得过紧。这种情况下，往往长至瓶(袋)中下部后，菌丝生长变缓，甚至不再生长。

　　3、大量污染　在正常情况下，原种和栽培种的污染率在10％以下，各个环节和操作规范者，常只有1％～5％。如果超出这一范围，则应该认真查找原因。造成污染的原因大致有以下几方面：

　　①、灭菌不彻底　这一原因导致的污染发生特点是污染率高，出现早，污染出现的部位不规则，培养物的上中下各部位均出现杂菌。这种污染常培养3～5天就可出现。影响灭菌效果主要有以下几个因素：

　　A、培养基的原料性质。不同材料导热性不同，微生物基数不同，灭菌所需时间也不同。因此，灭菌时要根据培养基的不同掌握灭菌时间。常用的培养基灭菌时间的关系是木屑<草料<木塞<粪草<谷粒，木屑种需时最短，谷粒种则最长。灭菌温度和灭菌时间必须严格按前文有关技术参数掌握，达到既要灭菌彻底，又要尽量少地破坏营养成分。因此，有条件的要尽量使用高压蒸汽灭菌。特别是粪草种和谷粒种。因为在高温条件下，微生物死亡比有机物破坏要来得快，从而达到缩短灭菌时间，既无菌又保护营养的目的，表3—5列出了细菌热致死温度和时间的关系。

　　表3-5细菌热致死温度和时间的关系(分)

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 全部(100％)致死　　　　　

　　细菌种类　　　90％致死所需时间　　　　　所需时间　　　　　　　温度(℃)

　　营养细胞　　　　　　　　　　　　　　2～3　　　　　　　　　　 50　

　　芽　孢　　　　　　　　　　　　　　　30　　　　　　　　　　　 7l　

　　枯草杆菌　　　　　11．3　　　　　　 15～60　　　　　　　　　 100　

嗜热脂肪芽孢杆菌　　 300　　　　　　　　3 000　　　　　　　　　　100　

　肉毒芽孢杆菌　　　　　　　　　　　　　300~530　　　　　　　　 100　

　产气荚膜杆菌　　　　0.3～17.6　　　　　　　　　　　　　　　　　 100　

　　丁酸杆菌　　　　　10～12　　　　　　　　　　　　　　　　　　 85　

　　从培养基原料的营养成分上说，糖、脂肪和蛋白质含量越高，传热性越差，对微生物有一定的保护作用，灭菌时间需要相对要长。

　　从培养基的自然微生物基数上看，微生物基数越高，灭菌需时越长。因此，培养基加水配制均匀后，要及时灭菌，以免其中的微生物大量繁殖，培养基中微生物基数增加影响灭菌效高，出现早，污染出现的部位不规则，培养物的上中下各部位均出现杂菌。这种污染常培养3～5天就可出现。影响灭菌效果主要有以下几个因素：

　　①、培养基的原料性质　不同材料导热性不同，微生物基数不同，灭菌所需时间也不同。因此，灭菌时要根据培养基的不同掌握灭菌时间。常用的培养基灭菌时间的关系是木屑<草料<木塞<粪草<谷粒，木屑种需时最短，谷粒种则最长。灭菌温度和灭菌时间必须严格按前文有关技术参数掌握，达到既要灭菌彻底，又要尽量少地破坏营养成分。因此，有条件的要尽量使用高压蒸汽灭菌。特别是粪草种和谷粒种。因为在高温条件下，微生物死亡比有机物破坏要来得快，从而达到缩短灭菌时间，既无菌又保护营养的目的，表3—5列出了细菌热致死温度和时间的关系。

　　表3-5细菌热致死温度和时间的关系(分)

全部(100％)致死

　　细菌种类　　　90％致死所需时间　　　　　　所需时间　　　　　　 温度(℃)

　　营养细胞　　　　　　　　　　　　　　　　2～3　　　　　　　　　　50　

　　芽　孢　　　　　　　　　　　　　　　　　30　　　　　　　　　　　7l　

　　枯草杆菌　　　　　11．3　　　　　　　　 15～60　　　　　　　　　100　

嗜热脂肪芽孢杆菌　　　300　　　　　　　　　 3 000　　　　　　　　　 100　

　肉毒芽孢杆菌　　　　　　　　　　　　　　 300~530　　　　　　　　　100　

　产气荚膜杆菌　　　　0.3～17.6　　　　　　　　　　　　　　　　　　　100　

　　丁酸杆菌　　　　　10～12　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　85　

　　从培养基原料的营养成分上说，糖、脂肪和蛋白质含量越高，传热性越差，对微生物有一定的保护作用，灭菌时间需要相对要长。

　从培养基的自然微生物基数上看，微生物基数越高，灭菌需时越长。因此，培养基加水配制均匀后，要及时灭菌，以免其中的微生物大量繁殖，培养基中微生物基数增加影响灭菌效

　　②、容器　玻璃瓶较塑料袋热传导慢，在使用相同培养基、相同灭菌方法时，瓶装种灭菌时间要较塑料袋稍长。

　　③、灭菌方法　高压灭菌和常压灭菌这两种灭菌方法．相比较而言，高压灭菌可用于各种培养基的灭菌，而常压灭菌对于灭菌难度较大的粪草种和谷粒种达到完全灭菌效果就很不容易。因此，为了确保灭菌效果，建议粪草种和谷粒种采用高压灭菌。目前技术发达的日本、美国等专业菌种场已采用超高温瞬时灭菌技术。高压灭菌的关键是要排放冷气干净，否则，灭菌室不能形成饱和蒸汽压力，灭菌温度达不到压力表所指示压力的对应温度，达不到彻底灭菌的效果(表3—9)。

表3－9冷空气排放程度与锅内温度、压力的关系
　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　温度(℃)　　　　　　　　　　　　　　　

压力(兆帕)　完全排除　排除2/3　排除1/2　排除1/3　不定量排除

　0.035　　　109　　　100　　　　94　　　　90　　　72

　0.069　　　115　　　109　　　　105　　　100　　　90

　0.103　　　121　　　115　　　　112　　　109　　　100

　0.138　　　126　　　121　　　　118　　　115　　　109

　0.172　　　130　　　126　　　　124　　　121　　　115

　0.207　　　135　　　130　　　　128　　　126　　　121

 

　　常压灭菌要注意，砌灶时锅体与灭菌室的相对位置要合理。如果灶体圆形，锅垒在中央，若灶体方形或长方形，四个角距锅最远，灭菌时气温最低，灭菌效果不好。因此，最好把灶内四角砌成圆形，以便灶内均衡升温，同步灭菌。同时，灶顶砌成圆拱形，利于冷凝水沿四壁下流而不打湿棉塞，利于培养期减少污染。锅小、锅口小、水少、蒸汽不足、火力不足，致，且出现早，接种3～5天内就可肉眼鉴别。

　　这类污染要靠严格检查菌种质量才能克服，不但使用前要认真仔细检查，而且要在培养全过程中连续检查和观察，以确保菌种纯度。

　　④、设备　设施过于简陋引起灭菌后无菌状态的改变　本来经灭菌的种瓶种袋已经达到了无菌状态，但由于灭菌后的冷却和接种环境达不到高度洁净无菌，特别是简易菌种场和自制菌种的菇农，达不到流水线作业专场专用，生产设备和生产环节分散，又往往忽略场地的大环境卫生，忽视冷却场地的洁净度，使本已无菌的种瓶种袋在冷却过程中就被污染。在冷却过程中，随着温度的降低，瓶内、袋内气压降低，冷却室如果灰尘过多，杂菌孢子基数过大，杂菌孢子就很自然地落到了种瓶或种袋的表面，而且随其内外气压的动态平衡向瓶内、袋内移动，当棉塞受潮后就更容易先在棉塞上定殖，或等待接种操作时碰触沉落进入瓶内或袋内。瓶袋外附有较多的灰尘和杂菌孢子时，成为接种操作污染的污染源。

　　要克服这一问题，必须改变“人人制菌种”的小农生产意识，放弃粗放工艺和简陋设备制种的小农经济生产方式，提倡专业生产、规模生产、规范生产。

　　⑤、接种操作污染　接种操作造成的污染发生特点是分散出现在培养基上表面，较接种物带菌和灭菌不彻底造成的污染发生稍晚，一般接种后7天左右出现。接种操作的污染源主要是接种室空气和种瓶种袋冷却中附在表面的杂菌，有的接种操作人员自身洁净度不良，也是很重要的污染源，如违反接种操作规程，没有做到使用专用无菌的白大褂，或白大褂表面附着尘土和杂菌孢子，或不戴口罩和工作帽，手臂消毒不良等，都是接种操作的污染源。这些污染源的存在，都是接种操作的巨大威胁。因此，要避免或减少接种操作的污染需格外注意以下主要技术环节：

　　A、不使棉塞打湿　灭菌码放时，切勿棉塞贴触锅壁，而要向内或向外，当棉塞向上摆放时，一定要用牛皮纸包扎。高压灭菌时要先夹层预热，进气由小到大。灭菌结束时，自然冷却．不要强制冷却。当冷却至一定程度后再微开锅门，让锅内的余热把棉塞上的水气蒸发。不可一次大开锅门，这样棉塞极易潮湿。

　　B、洁净冷却　有条件的规范化的菌种场，冷却室是高度无菌的，要保持冷却室的高度无菌状态，简易菌种场和自制菌种的菇农，也要使冷却室尽量的无菌、洁净，最起码地面不能有可见的尘土，灭菌后的种瓶种袋不能直接放在有尘土的地面上冷却。最好在冷却场所地面上铺一层灭菌过的麻袋、布垫或用高锰酸钾液浸泡过的塑料薄膜。冷却场所使用前进行空气消毒，可紫外线灯和喷雾相结合消毒。

　　C、接种室和接种箱使用前必须严格消毒　消毒处理前要将接种物和被接种物都码放好，以杀死它们容器表面附着的杂菌。

　　D、接种操作人员必须在缓冲间穿戴专用衣帽　专用衣帽要定期洗涤，并不可置于接种室之外，要保持高度清洁。有灭菌条件的，最好每次用前灭菌，以减少污染源。没有每次灭菌条件的，穿上后用蘸有消毒液的潮湿的消毒巾擦拭前襟，以减少灰尘和杂菌孢子的沉落。进入接种室前要认真洗手，操作前用消毒剂认真消毒双手。

　　E、接种过程要严格无菌操作，尽量少走动，少搬动，不说话，尽量小动作、快动作，以减少空气震动和流动，减少污染。

　　F、必须在火焰上方接种　实际上无菌室内绝对无菌的只有酒精灯火焰周围很小的范围内。因此，接种操作，包括开盖、取种、接种、盖盖，都应在这个绝对无菌的小区完成，不可偏离。二人接种时，要密切配合。

　　G、拔出棉塞使缓劲　拔棉塞时，不可用力直线上拔，而应旋转式缓劲拔出，以避免造成瓶内负压，外界空气突然进入而带人杂菌。

　　H、湿塞换干塞　灭菌时，可同时带灭菌一些棉塞，留接种时换下打湿的棉塞。

　　I、接种前做好一切准备工作，一次接种不间断，一气呵成。

　　J、少量多次　每次接种室消毒处理后接种量不宜过大，接种室以一次200瓶以内，接种箱以一次100瓶以内效果为佳。如果生产量大，可多个接种室或昼夜轮流接种，切勿只图省工省时，消毒处理一次而大量接种。切记每次接种前都必须严格消毒处理。

　　K、未经灭菌的物品切勿进入无菌的瓶内或袋内。接种操作时，接种钩、镊子等工具一旦触碰了非无菌物品，如试管外壁、种瓶外壁、操作台面等，决不可再直接用来取种、接种，必须重新进行火焰灼烧灭菌。掉在地上的棉塞、瓶盖切忌使用。

　　⑥、培养环境不洁及高湿　发生特点是，接种后污染率很低，随着培养时间的延长，污染率逐渐增高。这种污染较大量发生在接种10天以后，甚至培养基表面都已长满菌丝后贴瓶壁处陆续出现污染菌落。这种污染多发生在用废罐头瓶制作的原种和栽培种中。由于罐头瓶口大，不易封严，没有棉塞，常用聚丙烯薄膜封口，在洁净度不够的培养室极易出现大量污染。在有鼠、蚁、蟑螂等为害的情况下，使用塑料袋制种也常出现这类污染。

　　4、综合预防和处理措施

　　①、使用优良品种，从有信誉的专业机构引进菌种，如食用菌专门研究单位的福建省三明市真菌研究所、上海市农科院食用菌研究所、华中农业大学应用真菌研究所、福建农业大学菌草研究室、湖南长沙湖南省食用菌研究所、河南省科学院生物所、浙江农业大学园艺系、浙江省农科院园艺所、山西省科学院生物所、广东省广州市广东省微生物所、辽宁省辽阳市食用菌研究所、辽宁省朝阳市食用菌研究所、黑龙江应用微生物研究所等。食用菌菌种的专业保藏管理机构我国也有数家，是广大食用菌生产者的很好的种质资源库，这些机构均能提供来源清楚、性状明确、种质优良的各种食用菌品种，这些专业机构有：中国农业微生物菌种保藏管理中心食用菌实验室(设在北京中国农业科学院土壤肥料研究所)、中国林业微生物菌种保藏管理中心(设在北京中国林业科学院内)、中国普通微生物菌种保藏管理中心(设在北京中国科学院微生物研究所)。

　　为了确保菌种质量，切勿在菌种场、菇农间引种和交换。

　　②、按照食用菌菌种生产的特点规划和设计房屋，购置相应设备，提高专业化生产水平。

　　③、严格按照菌种生产的工艺技术要求选料、配料、分装、灭菌、冷却、接种、培养和检查。

　　④、严格挑选用于扩大的母种和原种，不使用有任何疑点的母种和原种，保证接种物的纯度。

　　⑤、提高人员技术素质，规范操作，规范生产，生产场地定期清洁、消毒，污染物定期灭菌处理，保持大环境的清洁状态良好。

　　⑥、专业菌种场要建立技术管理规章制度，以确保技术的准确到位，保证生产。