第六节　　菌种保藏

　　一、概述

　　蘑菇菌种和其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性。遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌和发生虫害。能够长期在生产上和研究上应用。

　　微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达到最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制菌丝的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。

　　二、保藏方法

　　（一）斜面冰箱保藏法

　　这是蘑菇菌种的一种短期保存法，因为它简单易行，不需特殊设备，并能随时观察保藏菌种的情况，因此也是常用的菌种保藏方法。

　　1、保藏方法

　　蘑菇菌种斜面冰箱保种一般使用PDA斜面培养基即可。菌种移接后，放在22-24℃温度下培养,要勤检查,当菌丝健壮地长满试管时,及时挑选无污染的培养斜面,棉塞用硫酸纸包扎后放置在4℃的冰箱中保藏。一般2-3个月转管一次。

　　2、注意事项

　　由于斜面冰箱保藏是在4℃下进行,微生物单孢分离物活动并未停止,需要经常转管移接,因此对于保藏所用的斜面菌种质量要求较高，其菌丝形态、菌落特征应保持原有特性，操作人员必须对斜面菌种质量应具有有一定的鉴别能力，所挑选的菌种才能适合保藏，其次菌种的菌龄不能太幼也不能太老，否则冰箱保藏后转管扩接易造成退化。再则冰箱温度应控制在2-4℃之间,尽量恒温使菌丝体处于稳定的生理状态。

　　（二）粪草管冰箱保藏法

　　1、保藏方法

　　粪草管的培养基是由腐熟麦秆粉100,腐熟牛粪粉25,麸皮8, 石膏粉1%,碳酸钙2%,含水量65%左右,pH7.5制备而成,调配后装入试管中,经高压灭菌后,接入菌种块,放在22-24℃温度下培养。要勤检查是否有污染，当菌丝健壮地长满草基试管时，及时挑选生长正常无污染的试管，棉塞头用硫酸纸包扎后放置在2-4 ℃的冰箱中,该保藏方法为中期保藏，一般2-3年转管一次。

　　2、注意事项

　　由于粪草管可保藏2-3年时间,因此如何防止粪草管的水分损失是该保藏方法时间长短的关键所在,一方面培养基含水量不能低于62%, 另一方面棉塞用硫酸纸包扎后可加些蜡进行封口,防止水分蒸发。 再则有条件应把试管保藏在具有保湿的冰柜或冰库中，温度控制在2-4℃,湿度控制在90%左右。

　　（三）液体石蜡保藏方法

　　液体石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与　空气接触，抑制菌丝的单孢分离物，可能使其处于休眠状态，推迟细胞衰老，延长菌丝的保藏，一般可保藏5-7年，是一种中长期的菌种保藏方法。

　　1、保藏方法

　　液蜡保藏蘑菇菌种的培养基为PDA斜面即可。将菌种块移接到PDA斜面上,在22-24℃下培养15-20天,然后用液体石蜡封藏保存。液体石蜡要选化学纯的，在121℃下高压灭菌30分钟,再将液体石蜡在160℃烘箱中加热1-2小时。亦可将高压灭菌后的液体石蜡放置在40-60℃温箱中,使灭菌后的液体石蜡层出现乳白色直至变成完全透明的无色为止,目的是将高压灭菌时侵入液体石蜡中的水蒸发干净。 将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1.0厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，置室温中保藏。

　　2、注意事项

　　菌丝的培养时间不能太短，为防止菌丝体的进一步发育，可适当延长菌龄或让试管先置在冰箱中(2-4℃)2天后再加入液体石蜡。倒入的液体石蜡要超过斜面尖端1.0厘米左右,如过低液体石蜡挥发后会露出斜面, 从而导致斜面培养基的干涸,缩短了保藏时间。烘烤液体石蜡应乇底，尽可能把水分蒸发干净， 防止水蒸汽蒸发导致棉花塞潮湿长霉而影响菌种的保藏。

　　（四）滤纸保藏法

　　将蘑菇孢子吸附在滤纸条上，干燥后放入冰箱进行保藏，由于该保藏是有性的孢子，一般不用于生产中，主要是起到保藏种质资源的作用及菌种的选育，根据福建省蘑菇菌种研究推广站的滤纸孢子保藏试验，用该方法已保藏蘑菇菌种达10年以上,孢子成活率约为50-80%之间。

　　保藏方法：孢子收集方法同单孢子分离的孢子收集，当滤纸条上收到有相当数量孢子后，用无菌镊子将滤纸条无菌操作放入无菌试管中，将该试管放在抽真空的干燥器中1-2天,除去滤纸条上水分使之充分干燥,随后把试管口封好,粘好标签, 放在冰箱中保藏。

　　（五）真空冷冻干燥保藏法

　　真空冷冻干燥简称冻干。这种方法是利用低温使孢子先冷冻，然后再在真空条件下，使孢子中的水分升华排出，孢子处于休眠状态，但仍保持原有活力，是一种长期保藏蘑菇孢子的保藏方法，具体操作如下。

　　①、选用内径8mm,长120mm的中性玻璃管作为制安瓿管的材料。将玻管用2% 盐酸浸泡8-10小时,再用蒸馏水洗2-3次后,置烘箱中烘干。将印有菌号、编号、 制作日期的标签放入安瓿管中，塞好棉塞，进行干热灭菌。
　　②、用接种铲将收集的蘑菇孢子铲入盛有3ml无菌脱脂牛奶的试管中,稍加摇动, 制成孢子悬浮液。用无菌吸管将孢子悬浮液移入安瓿管的球形部分，每管约0.2ml,然后将管口通过火焰,用无菌镊子取少许无菌棉花塞于安瓿管口。

　　③、将安瓿管放入无水乙醇与干冰混合的冻装置，温度可达-65～-70℃预冻5 分钟左右,也可在低温冰箱(-40)预冻30-60分钟。然后取出放入真空干燥器中， 用高真空活塞油封好立即抽真空，并随时用真空火花检漏仪检查真空度，发现有微小漏气处，要迅速用真空泥涂住。一般真空度应维持在10.7千帕以下,如抽真空10 分钟后仍达不到此真空度,说明真空系统不佳,可能会造成融化而失败。真空干燥器外面用1:3的盐冰水保温,其效果会好些,真空度稳定,一般抽7-8小时,可完全将安瓿瓶中水升华至干。此时应关闭缓冲瓶前的三道阀门，然后再断电。抽干后的安瓿瓶颜色应是白色，如果浅黄色或不成凹状，多数都因为真空度达不到要求而造成融化失败的结果。

　　④、冻干好的安瓿瓶要进行真空熔封。可用一个顶端多歧管或一个Ｚ型管，每个分支口都接入真空橡皮管以便将安瓿管接在橡皮管内，然后抽真空，边抽真空边用煤气喷灯熔封。熔封的安瓿　瓶要进行检漏，可用高真空火花检漏仪检查。安瓿瓶内呈蓝色荧光，说明真空封口良好，也可用微带红或蓝的清水浸泡安瓿瓶，经一昼夜安瓿瓶内无颜色水浸入，则为封口合格。

　　⑤、菌种安瓿瓶经无菌检查和存活率检查合格后，置2-8℃冰箱内保藏,一般蘑菇菌种可保藏8-10年。

　　⑥、复苏培养时，可在开启的安瓿管内注入0.3-0.5ml的无菌生理盐水或1% 麦芽汁。菌种安瓿瓶开启时，应先将安瓿瓶的封端加热，在浸有来苏尔等消毒液的湿布上擦一下，使管壁形成裂缝，然后再轻轻敲碎。切忌猛烈割断，以免空气骤然冲入，导致污染。安瓿瓶加入生理盐水后菌种即自行溶化，摇动后即成孢子悬浮液，可接入PDA培养基上,进行萌发培养。

　　（六）液氮超低温保藏法

　　液氮超低温保种是把菌种装在含有冷冻保护剂的安瓿瓶内，将该安瓿瓶放入液氮(-196℃)中进行保藏,由于菌丝体处于-196℃,其代谢降低到完全停止的状态。所以不需定期移植。从理论上讲，菌丝体可以无限期地存活。蘑菇菌种的液氮保种从1970年开始进行试验,至今已有20多年的历史,经过大量的试验证明液氮保种是菌种长期保藏的最有效最可靠的方法。随着方法的不断改良，现人介绍近年来应用的一种最简便的液氮保种方法。

　　①、菌种制备　菌种在PDA培养基平板上于22-24℃下培养10-15天,菌丝体充分生长后,用打孔器(直径2-4mm)打成小孔,或用接种针把菌丝培养物切成2×4mm 长方形小块。

　　②、安瓿管的制备　把直径4-6mm 的聚乙烯塑料管（也可用饮料吸管）截成小段做成安瓿管。每节大约60mm长,一头用热合机封好。然后用牛皮纸包装进行121℃下高压灭菌30分钟。

　　③、保护剂　10%的甘油水溶液进行121℃下高压灭菌30分钟可作为冷冻保护剂。用量为每安瓿上留有5-10mm的空间,用无菌注射器从管底注入,以防产生气泡。随后，且无菌接种针从安瓿管口放入5-8块菌种块，热合封好安瓿。 用记号笔在发瓿管外写上标签，最后在桌　上用一定的力按　压，以检查安瓿是否渗漏。

　　④、液氮保藏　把已做好的安瓿菌种管放入具有孔洞的小塑料瓶中（在塑料瓶的底部放一块铁片，使塑料瓶连同安瓿管能一起沉入液氮罐中），盖好瓶盖，在瓶盖上连接一条细绳并作记号，以便提出所需的菌种。把装有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安瓿管缓慢地降温，大约30分钟后,把 按瓿管浸入液氮中进行长期保存。

　　⑤、恢复培养　如果拟取用液氮保存的菌种，可将安瓿管取出后立即放入35-40℃的温水中迅速解冻,为了防止污染,用75%酒精洗安瓿管表面,表面干燥后, 用火焰烧过的剪刀在安瓿的一端剪开,用无菌接种针把菌块移接至PDA培养基上,置22-24℃培养。