灵芝菌种的分离方法有组织分离法、孢子分离法以及基质内菌丝分离法。这3种分离方法各有特点：基质内菌丝分离因易污染较少采用；孢子分离法又称有性繁殖，一般在研究及菌种复壮时采用；一般大规模生产时常采用组织分离法，该操作简便，且能保持原有菌种的优良品性。
一、子实体组织分离法
选取形态发育正常、无病虫害、未弹射灵芝孢子的灵芝子实体，菌盖边缘尚在生长的黄白色子实体。它们具有较强的再生能力和保持亲本种性的能力，属于无性繁殖范畴。组织分离取材广泛、操作简便、易于成功，是灵芝纯菌种的简便分离方法。
1、幼蕾分离 切取灵芝菌柄先端膨大的幼蕾，在无菌条件下，用75%酒精棉球擦拭，再用灼烧后的刀片从柄部浅切1刀，掰开两半后用锋利的接种刀挑切取幼蕾内菌肉1小块，移接至斜面中央，28℃下遮光培养，菌丝长满斜面即为母种。
2、菌盖分离 选取子实体生长正常、健壮和未成熟的子实体，切去菌柄，用75%酒精棉球擦拭菌盖正反面，然后在菌盖边缘黄白色生长圈处，切破皮壳，掰下一块幼嫩菌盖，用灼烧后的解剖刀在断面菌肉上作纵横切割成米粒大的组织片，置无菌培养皿内，最后用接种刀将组织片移接至斜面上，28℃下遮光培养。整个操作需严格无菌条件下进行。
未形成灵芝菌盖的幼嫩芝柄亦可作为分离材料。
二、灵芝孢子分离法
孢子分离法从灵芝子实体中收集成熟的有性担孢子，并将其培养萌发成纯菌丝的方法。由孢子分离得到的菌丝具有菌龄短、生活力强，同时有性孢子具有双亲的遗传特性，是选育新菌株和杂交育种的材料。但是孢子分离污染率高，经及时清理污染的试管。
1、孢子的采集 以赤芝为例，选取个体典型、菌盖呈红褐色、有光泽、发育成熟、无白色生长圈，瓶(袋)上见有少量散落孢子粉，大小适中，无病虫害的子实体，切去菌柄，用棉球蘸取0.1%升汞溶液，反复擦拭菌盖正反面，菌孔一面宜轻，然后用无菌水充分冲洗，并以无菌纱布吸干水分。孢子采集方法有以下几种：
①、弹射法 在无菌条件下，用灼烧后的粗注射针将切去灵芝菌柄处钻1个深达菌肉的小孔，插在培养皿的铁丝架上，培养皿放在铺有纱布的搪瓷盆内，外罩上钟罩或无底蘑菇瓶，置28－30℃相对湿度90%的条件下培养。当有大量褐色灵芝孢子粉落入培养皿后，除去钟罩及支架，将培养皿盖好，并用透明胶带封贴或无菌纸包扎备用。所用器材均需事先用纸包扎灭菌并进行无菌操作。
②、贴附法 锥形瓶(即三角烧瓶)内分装入1cm厚的PDA培养基，加棉塞灭菌，冷却成平板。无菌条件下将去柄的子实体如上述作表面消毒处理，放在无菌纸上，沿菌管方向切若干个小块，然后拔出锥形瓶塞，将子实体小块的皮壳部蘸上胶水粘贴在棉花塞底部，塞回锥形瓶口上。置28-30℃下培养，见有棕色孢子下落在培养基表面，即可在无菌条件下除去棉塞上的菌块。
贴附法也可粘贴在试管斜面正上方的管壁上。若菌盖厚可削去部分皮壳和菌肉，见斜面上散落有孢子时，除去菌块。
2、菌丝培养 在无菌条件下，把弹射法收集到的孢子，用接种环蘸取少许抖落在斜面上，或将孢子少许放入试管内无菌水中(采用20%灵芝子实体煮汁更理想)制成孢子悬液，然后蘸涂在斜面或平板上，置28－30℃下培养。贴附法在平板或斜面上接收的孢子，可直接适温下培养，约1周，待孢子萌发后，挑取萌发早、长势旺的菌落，移接至新斜面上，经培养即为母种。
野外分离灵芝孢子时因条件限制，可将菌肉（带菌管）贴在试管壁上，待孢子弹射入培养基后及时转管。
孢子萌发后先形成一级菌丝，几天后便可形成二级菌丝。如果在显微镜下观察到锁状联合，一般可确定为得到了灵芝菌丝。
孢子分离得到的菌种，由于其变异性较大，所以不应直接用于大面积生产，而是选择具有该品种其优良性状的后代进行组织分离后再用于生产。
三、基质内菌丝分离法
基质内菌丝分离法是利用灵芝生长的基质作为分离材料获得灵芝菌种的一种分离方法，也属于无性繁殖范畴。其优点在于灵芝子实体已衰老时仍可获得灵芝纯菌丝体。
基内菌丝分离法在灵芝中很少应用，因为灵芝子实体生长时间较长，且一年春夏秋均会发生，取材比其他食用菌简单，且子实体存放时间较长。只有在进行灵芝资源调查，或选用野生种进行驯化时，当灵芝子实体已释放完孢子和老熟无法进行孢子分离和组织分离的情况下才采用。
灵芝木基内菌丝分离方法是，选用长有灵芝子实体；无裂褶菌和其他多孔菌等生长的枯木或树根，常水冲洗去泥沙、杂质。摘去灵芝子实体，并从长子实体两边锯断，若芝木(根)较粗用刀纵劈成数块。在无菌条件下，用75%酒精擦拭消毒，将带柄基部分置酒精灯火焰上灼烧，用手术刀削去表皮，每削一次均需灼烧1次，以防交叉感染。然后将长有白色菌丝的切削面切刮下微小的木片或颗粒，用接种铲移接至PDA斜面中央，28℃下遮光培养，见白色灵芝菌丝生长并长满管即为母体。
分离时接种块应尽可能小些。所分离的菌种呀经过出菇实验确认是优良菌株才可在生产上使用。
其它品种也可借鉴本方法。
