木耳菌种分离新方法简介

杜萍1，2 崔宝凯1*
（1 北京林业大学微生物研究所，北京100083；2 黑龙江农业经济职业学院，牡丹江157041）

　　摘要　介绍了一种利用干耳组织分离木耳菌种的简便方法，分离效率高，操作时间短，节省材料，只需一小块耳片就能成功分离出所需菌种。

　　关键词　耳片组织分离无菌操作

　　近年来，随着山区开矿和城镇建没使木耳物种的数目日益减少，对木耳种质资源的收集、保存及研究成为一项必不可少的基础工作。而一株优良的木耳菌株经过多年的扩大生产使用，其优良特性会出现严重的退化现象，也必须进行重新分离复壮，为了保证木耳产业的正常发展，不间断地选育优良菌株势在必行。传统的选育菌种大多是通过组织分离方法，多用鲜耳直接分离或将干耳用水泡湿后再分离。目前也有采用干耳进行分离的，但程序繁杂，所用药品较多，条件差的地方难以做到。由于受多种药物的作用，即使分离成功，菌丝萌发和生长也很缓慢。黑木耳的耳瓣薄，并富有胶质，所以在过去的分离法中很少采用耳片组织分离。本方法克服现有的干耳菌种分离方法中所存在的操作复杂、成本高、菌丝分离成功率较低、质量差等缺陷，是一种操作简单，用材少（包括药品），成本低，菌丝萌发快，长势强，浓密，分离成功率高的干耳组织分离方法，以解决木耳的常规分离法所存在的一系列技术问题，为广大制种工作者提供方便。

　　1　供试材料

　　1.1　耳片来源

　　2008年将从江西省分宜县大岗山、海南省陵水县吊罗山、海南省昌江县霸王岭、重庆市重庆师范大学、湖北省武汉市黄鹤楼景区、河北省涞水县北辛庄等野外采集的黑木耳[Auricularia auricula（L.ex Hook.）Underw.]、毛木耳［Auricularia polytricha（Mont.）Sacc.]及皱木耳（Auricularia deli～cata（Fr.）Henn.）标本带回室内自然阴干或于28℃的烘箱烘干，干燥后即可用于组织分离菌种。

　　1.2　培养基制备

　　①、分离培养基：麦芽浸粉20g，琼脂18g，水1000mL，pH自然。将分离培养基煮好后趁热分装于5mL的离心管中，装液量为1.8mL，装于离心管架上，于121℃高压灭菌20min，灭菌后将离心管架倾斜摆放使培养基成一斜面备用。

　　②、纯化培养基：麦芽浸粉20g，葡萄糖20g，琼脂18g，磷酸二氢钾3g，水1000mL，pH自然。将纯化培养基煮好后趁热装于500mL的三角瓶中，用牛皮纸封口后于122℃高压灭菌20min。灭菌后趁热移至无菌超净工作台，分装于60gm×1.3cm的平皿中，装液量为13mL，将平板水平摆放，待培养基冷却后备用。

　　2　组织分离方法

　　2.1　材料准备　挑选朵型大、肉质厚、无筋或少筋、颜色正、无霉、无虫害野生或栽培的当年头茬干木耳1片放入无菌超净工作台内。每号标本准备10管斜面培养基。

　　2.2　用具准备　组织分离所用工具为剪刀和镊子，使用前在酒精灯火焰上方消毒即可。

　　2.3　组织分离及纯化培养

　　2.3.1　干木耳消毒并润湿　在超净工作台内将干耳片表面用75%酒精棉球擦拭2～3遍，用酒精棉包住耳片约2min。

　　2.3.2　剪取耳片组织块　用无菌剪刀将耳片四周边缘去掉，剪取远离耳基没有筋的最平部位的耳片，得到长0.5cm左右，宽0.2cm左右的组织块。

　　2.3.3　组织块灭菌消毒　用无菌镊子夹取该组织块在酒精灯火焰的外焰上方来回快速穿梭2～3次，每次1～2s。

　　2.3.4　分离培养　将组织块的1/3～1/2部位插入5mL离心管中的斜面分离培养基的中下部位之中；上述整个过程都要遵循无菌操作。将接种后的离心管插入离心管盒中（32管/盒），置于25℃恒温培养箱中培养。

　　2.3.5　纯化培养　分离培养5～6d后，挑取新生长出的菌丝作为接种块接种于纯化培养基中进行纯化培养。

　　3　结果与讨论

　　组织分离2～3d后，长势旺盛的可看到白色绒毛状菌丝，分离成功率达95%以上。在用干耳组织分离过程中若出现污染也只是细菌污染，几乎没有霉菌污染，因此可在分离培养中添加100ug/mL的青霉素钠来增强培养基抗细菌污染的能力”。另外，转管时如不慎，挑取了染有细菌的菌落，转管后几天内细菌长势较旺，无法纯化菌丝。因此转管时应将接种块插入培养基（最好用平板）内部，接种块露出培养基表面1/3即可，这样细菌在培养基内生长，待其长出表面时菌丝的生长势已明显强于细菌，培养1周左右待菌丝长到无菌区再次转管可获得纯菌丝。

　　试验采用的纯化培养基营养丰富，较适合木耳菌丝的生长，接种于60cm的平板培养基上，25℃恒温培养条件下生长势最强的菌丝6d就可长满平板，获得大量的木耳纯菌丝，菌丝生物量鲜重最高达到176.9mg/13mL，干重为70.8mg/13mL，长势中等的需10d，长势较弱的需10d以上长满平板。

　　此方法与传统的木耳组织分离方法相比主要具有以下优点：

　　①、方法简便，节省材料，只需一小片耳片就能成功分离出所需菌种，又能较稳定地保持原有菌种的优良特性。

　　②、分离效率高，操作时间短，不需要用酒精或升汞等长时间浸泡处理木耳耳片，只需要将干木耳的表面用75%酒精棉球擦拭2～3遍，用酒精棉包住耳片约2min，然后将耳片组织块从酒精灯火焰的外焰中快速的来回穿梭2～3次，就能在较短的时间内达到彻底消毒的效果。而现有的木耳组织分离方法中多是采用升汞进行消毒处理，升汞对周围环境有害，对木耳也有一定的不利影响，用升汞消毒后需要用清水进行反复冲洗；但是干木耳如果润湿过度，将其剪成耳片组织块后，由于缺乏硬度和韧性，无法将其顺利插入到分离培养基中并保持竖立，结果造成分离成功率非常低。

　　③、耳片经晒干已杀灭部分杂菌，经上述再处理，消毒较为彻底，组织块接种在母种培养基上时，很快吸收无菌水分、使耳片膨胀恢复萌发菌丝能力，分离成功率高达95%以上（常规分离法最高的分离成功率仅为80%左右），菌丝生物量高。

　　方法操作简捷，生产成本低，菌种分离成功率高，菌丝萌发快、长势强、浓密，适用于野生及栽培的黑木耳、毛木耳或皱木耳等多种胶质耳的组织分离，应用范围较广。

　　参考文献

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