韩增华 张丕奇 戴肖东 孔祥辉 马庆芳 张介驰　　食用菌学报

　　黑木耳(Auricularia auricula)是我国广泛人工栽培的食用菌品种,随着黑木耳栽培产业的不断扩大,促进产业良性发展的优良菌种成为关键。目前所用菌种主要来源于野生菌种分离和自然诱变育种,而关于原生质体诱变育种、杂交育种等研究较少[1,2]。
　　早在1972年DE VRIES和WESSELS用裂解酶分离得到了裂褶菌原生质体[3]。八十年代以后,食(药)用菌原生质体技术得到广泛发展[4~6]。目前食用菌原生质体技术已成为食(药)用菌生理、生化、遗传等基础理论研究和进行菌种改良的一种有效手段[7]。原生质体融合技术研究和单核杂交技术研究,都是以原生质体的成功制备与再生为前提条件[8~10]。本文探讨了黑木耳原生质体制备、再生的条件并对制备的单核菌株进行荧光染色鉴定,为黑木耳菌种选育提供参考。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1材料
　　1.1.1菌株
　　黑木耳菌株黑29、8808、981、HW2、HW5和139由黑龙江省科学院微生物研究所提供。
　　1.1.2培养基　　
　　OSF培养基:洋葱200 g(煮汁),蔗糖10 g,阿魏酸0.06 g,加水至1000 mL,用于制备原生质体前的黑木耳菌丝体培养。
　　液体再生培养基:土豆200 g(煮汁),甘露醇109.3 g,葡萄糖20 g,蛋白胨2.0 g,KH2PO4 3.0 g,酵母膏2.0 g,MgSO4 1.5 g,维生素B1 10.0 mg,加水至1000 mL,用于原生质体孵育。
　　CYM培养基:土豆200 g(煮汁),葡萄糖 20 g,维生素B1 10.0 mg, KH2PO4 3.0 g,蛋白胨2.0 g,酵母膏2.0 g,MgSO4 1.5 g,琼脂20 g,加水至1000 mL,用于制备高渗再生培养基。
　　高渗再生培养基:CYM培养基中分别添加蔗糖、甘露醇、MgSO4和KCl,浓度为0.5 mol/L,用于原生质体再生菌落筛选。
　　cPDA培养基:土豆200 g,葡萄糖20.0 g,硫酸镁1.5 g,KH2PO4 3.0g;蛋白胨0.5 g,维生素B1 10.0 mg,琼脂粉14.0 g,水1000 mL,用于母种、单核菌株培养。
　　1.1.3试剂
　　0.6 mol/L MgSO4高渗液;0.5 mol/L 的KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇稳渗剂:用0.05 mol/L pH 5.8的磷酸盐缓冲液配制;0.5%、1.0%、1.5%的溶壁酶:用0.05 mol/L pH 5.8的磷酸盐缓冲液配制0.6 mol/L MgSO4,然后用MgSO4溶液配置溶壁酶溶液;荧光核染料Hoechst33258:用0.1 mol/L柠檬酸缓冲液,pH 7.2配制荧光核染料[11]。

　　1.2方法
　　1.2.1菌丝培养
　　试管斜面中加入5 mL OSF培养基,用接种针挑取菌种表面菌丝,将此培养液接种于装有80 mL OSF培养基的三角瓶中(250 mL),25 ℃静置培养,备用。 
　　1.2.2原生质体制备条件筛选
　　选用菌株29为材料,借用正交试验表L9(34)进行原生质体制备条件的优化实验,试验因素和水平见表1。　　
　　无菌条件下用120目孔径的尼龙网过滤收集黑29菌株培养获得的菌丝体,无菌水冲洗1次,用0.6 mol/L MgSO4高渗液冲洗后,2000 ×g,离心10 min,收集的菌丝用0.6 mol/L MgSO4高渗液再冲洗1次,2000 ×g,离心10 min,用无菌滤纸吸干水分,按菌丝体∶酶液=1∶2(m∶V)的比例添加酶液,震荡2 min,混匀,在不同温度下振荡酶解不同时间,无菌条件下用300目尼龙网过滤,无菌管收集滤液,用0.6 mol/L MgSO4高渗液冲洗2次,3000 ×g离心5 min,沉淀用0.5 mol/L MgSO4稳渗剂洗涤离心(3000 ×g,5 min)2次,用0.5 mol/L MgSO4稳渗剂稀释至一定体积后,血球计数板计算原生质体数量。
　　1.2.3正交试验后的原生质体再生
　　将制备的原生质体溶液稀释至2×104个/mL后加入等体积的液体再生培养基,25 ℃静置孵育2 h,取孵育好的原生质体0.1 mL涂皿,采用0.5 mol/L的蔗糖高渗再生培养基,使每皿原生质体数目达到103个,25 ℃下静置培养20 d,观察平皿中的再生菌落数。
　　原生质体再生率计算:再生率=再生菌落数/原生质体总数×100%。
　　1.2.4稳渗剂对原生质体再生率的影响
　　收集菌株8808、黑29、981、HW2、HW5和139培养获得的菌丝,分别以0.5 mol/L的蔗糖、甘露醇、硫酸镁、氯化钾为渗透压稳定剂,其它因素参考正交试验筛选出的最佳条件,按1.2.2中的操作制备原生质体。采用相应的高渗再生培养基,原生质体再生按1.2.3中的操作进行,计算再生率,确定最佳稳渗剂种类。用筛选出的稳渗剂配置0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L系列浓度,按上述方法进行原生质体制备和再生,计算再生率。
　　1.2.5原生质体再生菌株培养
　　挑取涂布于蔗糖高渗培养基中萌发的菌落,于cPDA斜面上25 ℃培养15 d,将所获得的菌株编号,4 ℃保藏备用。
　　1.2.6单核与双核菌株荧光显微镜核相检测
　　将各双核菌株和再生的原生质体菌株分别接种于直径为88 mm的cPDA平皿中,距接种点约15 mm 处插一无菌盖玻片,25 ℃静置培养,待菌丝爬至2/5插片时,取已爬壁的菌丝插片,菌丝面向下,扣于已滴染色液的载玻片上, Hoechst33258染料染色3 min,于荧光显微镜下观察菌丝核相,确定单、双核菌株[11]。
　　
　　2 结果与分析
　　
　　2.1原生质体制备、再生正交试验结果
　　由表2可见,原生质体制备最佳条件组合是A2B3C1D2,即酶解温度31 ℃、酶浓度1.0%、菌龄5 d、酶解时间4 h。从R值可知,酶解温度对原生质体产量影响最大,其次依次为酶浓度、菌龄和酶解时间。
　　表3为原生质体再生率正交分析结果。表3表明,原生质体再生率最佳条件组合是A3B3C3D1,即酶解温度27 ℃、酶解时间4 h、酶浓度1.5%、菌龄11 d。对黑木耳原生质体再生率影响最大的因素是酶解温度,其次为酶解时间和酶浓度,影响最小的因素是菌龄。

　　2.2稳渗剂对原生质体再生率的影响
　　表4为0.5 mol/L的蔗糖、甘露醇、硫酸镁和氯化钾为渗透压稳定剂时原生质体再生的结果。表4表明,稳渗剂对黑木耳原生质体再生有很大影响,蔗糖对黑木耳原生质体再生效果最佳,再生率最高可达2.4%,其次为甘露醇和硫酸镁。氯化钾为稳渗剂时,原生质体再生效果最差,培养过程中无菌落萌发。相同条件下来源于不同菌株的原生质体其再生率也不同,以蔗糖为稳渗剂时,139菌株原生质体再生率最低,而HW2、HW5菌株的再生率较高。　　
　　表5是以0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L蔗糖为稳渗剂时,不同菌株原生质体的再生率。当蔗糖浓度为0.5 mol/L时,各菌株的原生质体再生率最高,在此浓度下HW5和HW2的再生率分别达2.4%和2.1%。

　　2.3不同菌株原生质体单核化比率
　　表6为不同菌株原生质体单核化比率。表6表明,单核比率最高的是HW2菌株,为35%;981菌株单核比率最低,仅为14%。

　　2.4单、双核菌株的荧光显微镜核相
　　图1可见,荧光显微镜下各菌株单、双核清晰可辨,供试的6个菌株制备的单核,其菌丝分枝较双核菌株少,核距远,菌丝交叉较少,在cPDA培养基上生长较细弱。
　　
　　3 讨 论
　　
　　正交试验结果表明,对原生质体制备及再生影响最大的因素是酶解温度,菌龄对原生质体制备影响较大,但对再生率影响较小;酶解时间对原生质体制备率影响不大,但对再生率有一定的影响;黑木耳原生质体制备的最佳条件是酶解温度31 ℃、酶浓度1.0%、菌龄5 d、酶解时间4 h;原生质体再生的最佳条件为酶解温度27 ℃、酶解时间4 h、酶浓度1.5%、菌龄11 d。
　　
　　稳渗剂对原生质体维持正常的渗透压至关重要,其种类和浓度对原生质体的分离有着较大影响[12]。据报道,无机盐、糖类及糖醇都是适宜的渗透压稳定剂[4],不同稳渗剂对原生质体制备、再生有很大的影响[13,14]。本研究表明,以0.5 mol/L蔗糖为稳渗剂时有利于黑木耳各菌株原生质体的制备和再生。

　　荧光核相观察是一种较直接的鉴别单、双核菌丝的方法,是目前快速区分单、双核菌丝的有效方法,荧光显微镜下单、双核菌株清晰可辨,但要鉴别两个核是同源或异源,还必须结合其它分析方法。本实验通过核相观察,确立了单核和双核菌株,为进一步核相鉴定提供了试验材料。研究还发现单核菌株在cPDA培养基下培养易形成分生孢子,具体的形成规律和机理尚有待进一步研究。
　　
　　[1] 郭砚翠,刘凤春,王亚茹,等. 黑木耳原生质体再生菌株选育高产菌株研究[J]. 食用菌学报,1994,1(2):7-10.
　　[2] 刘国振,贾建航,李莉云,等. 原生质体诱变技术选育香菇菌株研究[J]. 食用菌学报,1997,4(4):11-16.
　　[3] DE VRIES OMH,WESSELS JGH. Release of protoplasts from Schizophyllum commune by a lytic enzyme preparation from Trichoderma viride[J]. J Gen Microbiol,1972,73:13-22.
　　[4] 刘祖同,罗信昌. 食用蕈菌生物技术及应用[M]. 北京:清华大学出版社,1999:66-124.
　　[5] 何培信,罗信昌,李来泉,等. 木耳原生质体技术的研究及应用[J]. 河南职技师院学报,2001,29(2):22-24.
　　[6] 戴秉丽. 原生质体技术在食用菌育种中的应用研究[J]. 中国食用菌,1995,14(5):15-16.
　　[7] 杨新美. 食用菌研究方法[M]. 北京:中国农业出版社,1998. 
　　[8] 王伟霞,李福后. 茯苓原生质体制备与再生条件的研究[J]. 菌物研究,2006,4(4):65-68.
　　[9] 孙 溪,郭成金. 双孢蘑菇原生质体制备条件的优化[J]. 天津师范大学学报(自然科学版),2006,26(4):32-35.
　　[10] 李 刚,李宝健. 灵芝原生质体分离与再生研究[J]. 菌物系统,1999,18(1):79-80. 
　　[11] 罗信昌,陈大年. 食用真菌核荧光染色技术的研究[J]. 真菌学报,1990,9(1):64-68.
　　[12] 李铁超,马淑凤,李书倩,等. 白灵菇原生质体制备与再生的研究[J]. 食用菌,2006,(2):10-13.
　　[13] 张 渊,王 谦,张筱梅,等. 茶薪菇原生质体制备及诱变的研究[J]. 中国食用菌,2004,23(3):15-17.
　　[14] 张 卉,刘长江. 姬松茸原生质体形成和再生的研究[J]. 微生物学杂志,2003,23(3):18-23.
　　朱丽娜
　　
　　Preparation, Regeneration and Identification of
　　Monokaryotic Protoplasts of Auricularia auricula
　　HAN Zenghua,ZHANG Piqi*,DAI Xiaodong,KONG Xianghui,
　　MA Qingfang,ZHANG Jiechi 
　　Institute of Microbiology, Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin, Heilongjiang 150010, China
　　Conditions for the preparation and regeneration of Auricularia auricula protoplasts were optimized using orthogonal testing. Highest protoplast yields were obtained from 5-day-old mycelium after treatment with 1.0% (w/v) lywallzyme for 4 h at 31 ℃, while the highest protoplast regeneration rate was obtained from 11-day-old mycelium after treatment with 1.5% (w/v) lywallzyme for 4 h at 27 ℃. Of four osmotic stabilizers tested (sucrose, mannitol, MgSO4 and KCl), the highest rate of protoplast regeneration was obtained using 0.5 mol/L sucrose. Monokaryotic and dikaryotic mycelia were readily distinguishable using fluorescence microscopy. The highest rate of monokaryotic protoplast formation was recorded with A. auricula, strain HW2.
　　Auricularia auricula;protoplast;regeneration;monokaryotic protoplast;fluorescence staining of nuclei