“裕灌杯”获奖论文选登
阐释我国羊肚菌外营养袋栽培技术的发展历程（上）
本文刊于《食药用菌》杂志2019年第4期，荣获“裕灌杯”2019年度优秀论文评选活动“二等奖”。
作者简介：
谭方河，四川省林业科学研究院副研究员，重庆美哉菌业有限公司技术总监。长期从事羊肚菌新品种选育及高效栽培技术研究，曾获得国家科技进步二等奖、部省级科技进步一等奖，曾先后到意大利、美国及法国访问考察学习，首创羊肚菌外营养袋栽培技术，极大地促进了羊肚菌人工栽培技术的发展。
阐释我国羊肚菌外营养袋栽培技术的发展历程（上）
谭方河1，2
（1. 四川省林业科学研究院，四川成都 610000；2. 重庆美哉菌业有限公司，四川成都 610081）
羊肚菌为珍稀食用菌，食之味美，我国从20世纪80年代开始人工栽培研究。经历栽培不出菇、出菇不稳定、能出菇无产量等阶段，至今没有形成真正意义上的商业化栽培技术体系。
四川省林业科学研究院经过16年的努力，于2003年研发成功外营养袋技术，有效推动了羊肚菌商业化栽培的发展。至此，外营养袋技术、有效的栽培品种、恰当的栽培管控，遂成为我国羊肚菌室外大田栽培的三大技术支撑。其中最关键的是外营养袋技术，其解决了人工栽培条件下营养的有效供给问题。
1 国外羊肚菌商业化栽培技术发展
1.1 美国划时代羊肚菌专利技术
野生羊肚菌的人工驯化栽培研究，一直以来都是全球乐动体育热门赛事
者、科技工作者热衷探索的领域。早在136年前的1883年，法国人Roze就在室外成功培育出羊肚菌子实体，这是文献记载的最早案例。其后的100年里，报道实例渐多，但人工栽培出菇的可重复性问题一直没有解决，成为名副其实的世纪难题。直至1980年，美国旧金山大学一位在职博士研究生D. Ower在人工气候室内培育出羊肚菌子实体，这一重要成果于1982年发表在美国真菌学学报《Mycolagia》上（Notes on the Development of the Morel Ascocarp: Morchella esculenta, Mycologia 74: 142-143. 1982）。之后他与有关公司合作，历经数年形成羊肚菌人工栽培历史上第一个专利（4,594,809. U.S. 1986；4,757,640. U.S.1988; 4,866, 878. U.S. 1989.），专利发明人为Ronald D. Ower, Gary L. Mills和Malachowski。但令人遗憾的是，Ower 本人在专利公布前夕不幸亡故，该专利经过后继者的努力，最终基本实现了室内周年化栽培。
该项专利的关键技术都属原创，包括羊肚菌菌核培育工艺、羊肚菌原基形成及子实体培育等。最终形成以生产菌核作为营养库栽培羊肚菌的工艺方案。在人工栽培技术原理上，此方案尚有两个重大技术难题没有得到解决：一是栽培品种的选择，二是营养补给。该专利信息量丰富，所述内容真实，但读者很难看明白，难以把握其核心，以至于此专利公布后，全世界羊肚菌栽培者虽多有模仿，但室内、室外栽培，竟无一例成功。因此长期以来，全世界只有美国专利拥有者能进行羊肚菌人工商业化培育，从而给羊肚菌人工栽培技术蒙上了一层神秘的面纱。
该专利在美国的生产实践持续20余年，然而其羊肚菌生产一直跌跌撞撞，并不顺利，生产运行最顺利的年份，年产量也仅10吨左右（按干品计，实际销售为新鲜羊肚菌，价格长期居高）。这一产量对于美国羊肚菌消费市场而言，实在微不足道，而对世界羊肚菌栽培与加工产业的发展影响更微。更令业界意外的是，美国羊肚菌工厂化栽培在2007—2008年间走到了尽头，真实原因是产量不稳定，满足不了生产订单需要，而须对购买方进行赔偿，导致工厂难以为继。
此外，美国羊肚菌室内周年栽培专利发明者之一Malachowski，在美国羊肚菌专利早期转让过程中分得利益，主动脱离了专利拥有者团队，终身不得从事专利所保护的羊肚菌室内栽培技术。但是这位专利发明者，到了北加利福尼亚州一个名叫Graton的小镇，另起炉灶创新了一种后花园羊肚菌栽培方法，出售菌种和栽培技巧，小公司运营了近30年，但是其栽培方法中也不涉及外营养添加程序，依然没有解决羊肚菌人工栽培可重复性与高产性问题，仍算不上真正的商业栽培技术。
另在2000年，有以色列学者曾宣称成功掌握了羊肚菌室内培育技术，并在互联网发布消息称其技术超过了美国专利，且预计在四五年后，全世界主要羊肚菌消费市场将有以色列人工栽培的羊肚菌应市。以色列曾组建羊肚菌生产公司并开展商业化栽培，但时至今日，在世界羊肚菌市场上未见到以色列人工栽培的羊肚菌产品。
分析原因，认为美国羊肚菌室内工厂化栽培技术并未完全成熟。羊肚菌这种特殊子囊菌，在实施工厂化栽培过程中远不如其他食用菌类（主要是担子菌）稳定，运行成本高且效果不确定。因此，全世界尚未形成在商业上立得住脚的真正的羊肚菌工厂化栽培技术。
1.2 羊肚菌商业化栽培的两大技术难题
一般认为，因为不了解羊肚菌的生活史，所以早年的羊肚菌栽培研究难以成功。在营养生长向繁殖生长转化这个环节上，有3种说辞：一是子囊菌不同型的菌体配合说，二是伴生菌假说，三是“公母孢子”推论。美国的室内专利公布后，更是让不少栽培探索者以为羊肚菌子实体形成必须要有菌核。然而事实证明，伴生菌及“公母孢子”，以及羊肚菌由菌核发育而成的推论，都是错误的。
国际上早有学者研究认为，有的羊肚菌属于菌根菌，具有共生特征，栽培难度很大。事实上，羊肚菌有共生型、兼性寄生型，以及纯腐生型3种不同营养类型。除了纯腐生型，其他类型难以进行人工驯化栽培。而腐生型的菌株，很多情况下也难以驯化栽培，即便出菇也不具有商业价值。如黄色羊肚菌类群，其在世界上广泛分布，菌株易获得，但是栽培驯化却十分困难；黑色羊肚菌类群中的很多菌株也很难栽培。早期许多羊肚菌栽培探索者，多用本身就没有商业栽培价值的菌株进行驯化栽培测试，结果铩羽而归。这是长期以来无法突破羊肚菌商业化栽培技术的一个重要原因。
即便巧获一个在栽培上可操作性强的纯腐生型羊肚菌菌株，仍存在一个对营养的补给问题。常规培养腐生食用菌的营养供给方式不足以满足羊肚菌的营养需要。一百多年来，时有报道羊肚菌栽培长出子实体，但不能解决重复性问题。人工栽培能够长出子实体，说明栽培者使用的菌株是可以驯化的好菌株，而不能重复、产量不高，主要是因为没有解决关键的营养供给问题。
2 我国羊肚菌外营养袋栽培技术的产生与发展历程
2.1 外营养袋技术的产生
1994年，四川省绵阳食用菌研究所申请获得我国第一个羊肚菌大田栽培技术专利。虽然后来的实践证实，该栽培专利还存在重复性差和产量不高的问题，尚不是一个具有商业价值的技术。但是经过有关团队的商业宣传运作，尤其是在央视农村频道的播出，让很多单位或个人都加入到了羊肚菌的早期人工栽培探索之中，一定程度上推动了我国羊肚菌产业的发展。
四川省林业科学研究院羊肚菌课题组（以下简称课题组）的科技人员，在上世纪90年代借助世界自然基金会（WWF）的相关项目，开始涉足野生羊肚菌的人工栽培驯化研究工作。1994年，采用我国专利申请单位的菌株及多年来收集的羊肚菌菌株进行栽培试验，均未能获得子实体。之后舍弃所有栽培测试菌株，采用在四川特定区域收集分离的几十个野生羊肚菌菌株，在成都下沙河铺进行栽培试验，其中来源于青川县乔楼镇的几枚子实体（后来测定属于六妹羊肚菌）的孢子分离菌株和组织分离菌株，播种到土壤之后在土壤表面出现白色，看起来像一层霜（后来称为菌霜）。
当时对此感到非常惊奇但不知为何物，请教国内有关真菌方面的专家也没有得到破解。后查阅国外羊肚菌栽培文献，包括美国专利、法国最早报道的室外栽培出菇案例等，其中提到羊肚菌有分生孢子。在显微镜下观察发现，羊肚菌分生孢子不容易萌发，很难培育出菌丝。曾设想这种分生孢子是否与羊肚菌栽培成功有关联。基于这种认识，其后只用能产分生孢子的菌株继续进行栽培探索，极大地减少了工作量。随后按照一般食用菌的栽培思路，先后采用多种植物秸秆（如麦草秸、玉米秸、谷草秸、大豆秸、油菜秸、红薯藤、花生秸等凡能找到的农作物秸秆）进行全发酵、半发酵、生料或熟料等多种原材料处理方式，结合不同播种方式，进行播种试验，参照传统土生食用菌如鸡腿菇、双孢蘑菇等的栽培方式，在营养方面下足了功夫，但仍然没能培育出羊肚菌子实体。然而，正是由于一直用能产生分生孢子的菌株做试验，方向正确，为后来的外营养袋技术奠定了成功的基础。
鉴于多种营养配方都栽培不出羊肚菌子实体，课题组猜想需要从遗传角度努力。后经查阅经典真菌学文献，发现子囊菌里有的种类形成子实体需要两种极性不同的菌丝配合，形成双核菌丝体，才可能获得子实体。按此思路，用采集到的成熟野生羊肚菌子实体（栽培时能产生分生孢子的），分离出子囊单孢子菌株，将不同的单孢子菌株在平板上进行对峙培养，观察到栅栏现象及不同种单孢子菌丝接触后的不同反应，其中编号为1-1和2-8的单孢子对峙培养后，总是发生菌丝爆发性生长现象，表明这两个子囊单孢子菌株很可能属于不同的配对型。猜想羊肚菌子实体的产生可能是不同类型单孢子菌株配对的结果。于是栽培驯化重点从营养材料转为菌株配对测试。这一研究过程采用倒扣瓶方式：将两个单孢子分别培育为菌种，其中一个菌株按照常规方法播种于花钵内与土混合后盖上土壤，另一个菌株培养于玻璃罐头瓶内，菌种不取出，直接将瓶口倒扣于花钵表面，让两个菌株密切接触。结果出现了“奇迹”，花钵内居然长出了1枚羊肚菌子实体。这给试验者带来了极大的震撼，它让羊肚菌栽培试验继续向前引导出外营养方向。
1999年的重复试验，在同样大小的花钵内长出了4枚子实体，这一结果让实验设计者坚定地认为羊肚菌人工栽培出菇必须要两种极性不同的菌株配对融合形成双核体。从1998年到2003年这6年间，扩大了测试，用两种单孢菌株，以倒扣瓶的接触方式进行栽培都可以形成子实体，在出菇方面具有可重复性。既然两个菌株以倒扣瓶的接触方式可以出菇（猜想不同极性菌株之间的融合发生了作用），若将两个菌株分别大量培养成菌丝体，再将两种代表不同极性的菌株混合播种，菌丝之间可谓立体接触，这样融合的机率更大，推测发生原基及出菇的概率也会更大。于是将两个单孢子菌株分别培养为大量菌种，并将其充分混合，再播种于试验地块，结果却事与愿违，根本没有长出子实体。研究工作又陷入了困局中。随后，研究人员又多次反复研读了美国1986年发布的专利，猜测出菇与否可能与营养添加方式有某种联系。为了验证这个新想法，在随后的栽培试验中，采用一个单孢子菌株进行播种，待菌丝穿出土面产生大量菌霜后，倒扣上装有小麦等营养物质并经过灭菌处理的营养瓶，结果令人惊喜：倒扣纯营养瓶的形成原基的数量更多，不论是用哪种极性的单孢子菌株，都能通过这种方式获得羊肚菌子实体。至此，课题组才从菌丝配合产子实体的误区中走出来，发现并证明外营养补给方法对羊肚菌原基形成及子实体生长有重大促进作用。
为了操作方便，后来将玻璃瓶换为软体塑料袋，也就是现在大量应用的塑料营养包。在营养包放置方式上，立袋倒扣方式一直持续到2012年，2013年变为横袋。横袋补给方式养分利用更加高效，操作也更方便。营养袋放置时间，从2003年的播种后15～20天形成分生孢子后才放置外营养袋，到2018年的播种后一周内放置营养袋，其间用了15年的时间。播种一周内放置营养袋，菌体更具活力，利用养分效果更好，抗杂性更强。
从1998年花钵中长出的第一枚子实体被误认为是因两种单孢子菌株配合形成开始，至2003年最终发现羊肚菌外营养袋的独特作用，经历了6年时间。这种奇特的营养补给方式极大地提高了羊肚菌人工栽培的可重复性及产量。后经过七八年的生产实践和总结，到2010年左右，逐步完善了羊肚菌外营养袋栽培体系。在该技术体系形成的早期，不少单位及个人，如四川省理县林业局、四川理县林业局薛城林场、四川省南江县林业局、四川省洪雅县林业局、四川省青川县科技局、四川省青川县移民局、成都市虹禾原野物产有限公司、成都市虹雨菌业有限公司等，都做出了重要贡献。惜这些单位或个人，如今已基本离开了这一技术领域，有的企业早已倒闭。因此，若将羊肚菌外营养袋栽培技术比喻为一个“婴儿”，那么这个“婴儿”诞生于四川省林业科学研究院。
研究期间，课题组获得的项目资助有：（1） 四川省应用基础研究项目“黑脉羊肚菌人工栽培驯化机理研究”。起止时间：2000—2002年；总经费3万元。（2） 四川林科院自立项目“黑羊肚菌人工栽培驯化机理研究”。起止时间：2000—2001年；项目经费2万元。（3） 四川省科技厅“十五”四川省农作物育种攻关项目：蔬菜（食用菌）新品种选育和引进项目（2001-11）“珍稀野生食用菌新菌株驯化研究”的子项目（2001-11-06），珍稀野生食用菌新菌株的驯化研究子专题（编号2001-11-06-17），野生羊肚菌新菌株驯化栽培方向。起止时间：2001—2005年；总经费10万元。（4） 四川省林业厅“先导计划”科研项目“黑脉羊肚菌人工栽培技术研究”课题。起止时间：2001—2003年 ；经费3万元。（5） 国家科技部“西部开发科技动力”项目 “四川省秦巴山区绿色食品开发”课题，“羊肚菌新品种选择及无公害栽培技术”子课题。起止时间：2001—2004年；总经费20万元。（6） 四川省科技厅“十一五”四川省农作物育种攻关项目“优质高效专用抗逆经济作物新品种选育项目：蔬菜新品种选育课题（编号2006-06-04-06）”，珍稀野生食用菌新品种羊肚菌驯化与选育子专题。起止时间：2006—2010年；总经费20万元。（7） 国家林业局项目“羊肚菌优良菌株选育技术引进”（编号2004-4-22）。起止时间：2004—2007年；总经费50万元。
以上研究项目均由国家有关部门（体系内）提供经费支撑，总计108万元，在羊肚菌外营养袋栽培技术形成和发展的早期起到了决定性作用；而羊肚菌外营养袋栽培技术在形成及完善过程中，耗费民营经济实体企业的资本（体系外）远超千万元。在羊肚菌外营养袋技术形成与完善过程中，更多的社会资本（企业资本）做出了很大的贡献。
2010年之前，在野生羊肚菌驯化过程中，一直采用野生羊肚菌目标菌株结合外营养袋栽培测试确立栽培新菌株。多年实践选育出编号为101，201，301，401，501，904，2021，2022等可供栽培的新菌株。这些菌株随着羊肚菌外营养袋栽培技术的推广而逐渐被采用，流通于业界，客观上成为栽培菌株自然的选育环节。后来的科研单位将这些菌株进行遗传分析确定为梯棱、六妹、七妹羊肚菌等，从科学的角度规范了名称，对技术的推广应用起到积极促进作用。
2.2 外营养袋技术的传播与推广
早年四川省林业科学研究院的技术人员虽然在羊肚菌人工栽培技术研究上获得重大突破，但距离商业化栽培尚有较大距离。羊肚菌外营袋栽培技术在形成和完善的过程中逐渐远离了本单位体系，加上早期未获得原创单位系统的足够重视，经费日益紧张，课题组于2005年与当时的“虹禾原野物产有限公司”合作，在四川省双流县进行50亩（1亩≈667平方米，下同）的大田栽培中试，取得良好效果。2006年开始与成都市“虹雨菌业有限公司”合作，在2007年、2008年及2009年，用梯棱羊肚菌菌株301栽培，局部获得400千克/亩的产量，这是验证该技术获得高产的最早例证。2008年末，课题组的主要成员参观访问美国羊肚菌专利发源地——旧金山，并于2009年带回一批可供栽培的外来菌株，其中菌株2022被国内有关单位测定定名为七妹羊肚菌。这期间课题组的一个外来雇员开始到四川崇州开办简易菌种厂独自创业，将羊肚菌外营养袋技术及有效菌株传播到了四川金堂、什邡、绵阳等地，后来绵阳食用菌研究所的羊肚菌栽培基本上都采用了外营养袋技术，其他羊肚菌栽培企业也都纷纷采用该技术。2012年四川省农业科学院在金堂、什邡及绵阳游仙区等地采用该技术获得了显著的效果，其后开始发挥平台的作用，使该技术在中国特别是西南的四川等地得以迅速推广。到2018年，全国羊肚菌栽培总面积达到12万亩左右，干品总产量1 000吨左右。
就世界范围而言，目前仅有两条可供羊肚菌商业化栽培的技术路线：其一是美国羊肚菌室内周年化栽培技术，其二就是我国流行的羊肚菌外营养袋栽培技术。实践表明，美国室内周年化栽培技术并不是一项成熟的商业化技术，该技术在美国运行多年，实施成效并不理想。羊肚菌大田外营养袋栽培技术侧重在大田栽培，已经形成较为完整的技术体系，有很大的商业应用价值，生产应用已初具成效，显现出强劲的应用潜力，但仍处于初级发展阶段，其产量还不稳、不高，尚需进一步深化完善。（待续）
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