微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数

　　一、实验原理
　　稀释平板测数是根据微生物在高度稀释条件下固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的繁殖稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使其成单个细胞存在，否则一个菌落就不只是代表一个细胞，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此记数方法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些产品检定，如根瘤菌剂等产品检定，生物制品检验，土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。
　　自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体。为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
　　在自然界中，土壤是微生物生活的良好环境，其中生活的微生物数量和种类都是极其丰富的，因此土壤是人类开发利用微生物资源的重要基地。土壤中的微生物数量、种类与土壤肥力有关，肥沃的土壤中多，贫瘠土壤中少。其生理类群则与土壤的其它理化性质，如通气、pH有关，例如在通气良好的菜园土中，好气性微生物占有绝对优势。本实验以菜园土为材料分离土壤中的好气性细菌，并进行数量测定。
　　分离微生物时，一般是根据该微生物对营养、pH、氧气等要求的不同，供给它们适宜的生活条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其它菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法，根据不同的材料，可以采用不同方法，其最终目的是要在培养基上出现欲分离微生物的单个菌落，必要时再对单个菌落进一步分离纯化。在用稀释平板分离微生物时，还可以同时测定待分离的微生物的数量。
　　放线菌与细菌同属原核微生物，是重要的抗生素产生菌，在土壤中的数量仅次于细菌，尤其是在有机质丰富、透气性好的中性到微碱性土壤中的数量较多。本实验采用高氏一号琼脂培养基分离和计数菜园土中的放线菌。
　　真菌在土壤中的数量次于细菌和放线菌，主要在有机质丰富、透气性好的偏酸性土壤中较多。分离土壤中的真菌并不难，但由于其菌落大，容易扩展，计数准确性较低。本实验采用加有氯霉素或庆大霉素和孟加拉红的马丁氏培养基分离及计数菜园土中的真菌。按一般资料介绍为链霉素，但此种抗生素要先配成一定浓度的溶液，且应于倒平板前才加入培养基中。在此培养基上，放线菌和细菌被氯霉素或庆大霉素和孟加拉红所抑制，但大多数真菌能够生存，且其菌落受孟加拉红的抑制而较小，从而避免了某些真菌的扩散蔓延而带来的数量上的误差。
　　二、实验材料
　　1、活材料：苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）菌剂。
　　2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；高氏一号琼脂培养基；加有氯霉素（或庆大霉素）和孟加拉红的马丁氏琼脂培养基:在1000ml培养基中加入注射用氯霉素2ml，孟加拉红33.4mg，均于灭菌前加入。
　　3、材料：肥沃茶园土。
　　实验用品
　　内装15～20个玻璃珠的90ml无菌水、9ml无菌水、直径9cm的无菌平皿、1ml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲、经2mm土壤筛过筛的菜园、天平、试管架、无菌称量纸、酒精灯、火柴、接种环、无菌水。
　　三、实验方法
　　1、稀释平板测数法
　　①、样品稀释液的制备
　　准确称取待测样品10g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10－1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10－1稀释液1ml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10－2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10－2稀释液1ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸3次，即成10－3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9等一系列稀释菌液。
　　用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10－7、10－8、10－9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10－4、10－5、10－6稀释度，测定放线菌数量时，采用10－3、10－4、10－5稀释度，测定真菌数量时，采用10－2、10－3、10－4稀释度。
　　②、平板接种培养
　　平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。
　　A、混合平板培养法
　　将无菌平板编上10－7、10－8、10－9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取1×10－9稀释液各1ml放入编号10－9的3个平板中，同法吸取10－8稀释液各1ml放入编号1×10－8的3个平板中，再吸取1×10－7稀释液各1ml放入编号1×10－7的3个平板中，由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换。然后在9个平板中分别倒入已熔化并冷却至45～50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，在30℃下培养。至菌落长出后即可计数。
　　B、涂抹平板计数法
　　涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上，每个编号设三个重复。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20～30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至菌落长出后即可计数。

图示 稀释平板测数法中样品的稀释和稀释液的取样培养

　　2、土壤中好气性细菌的分离与计数
　　①、土壤稀释液的制备
　　按“稀释平板测数法”的相同步骤进行，按无菌操作法将土壤稀释至10－6即可。
　　②、分离方法
　　可以用三种方法进行分离。
　　A、混菌法：按“稀释平板测数法”中的“混合平板培养法”进行，使用的稀释度为10－4、10－4、10－6三个，各做3个重复。
　　B、涂抹法：按“稀释平板测数法”中的“涂抹平板测数法”进行，使用的稀释度为10－3、10－4、10－5三个，各做3个重复。
　　以上两法又统称为稀释平板分离法，可同时用于所分离菌的计数。
　　C、划线法：用灭菌接种环沾取10-1稀释液1环于已凝固的平板上进行划线（图示）。划线可按以下两种方式进行，一种为交叉划线法，是在平板的一边做第一次“Z”字形划线。转动培养皿70°角，将接种环在火上烧过并冷却后，通过第一次划线部分，做第二次“Z”字形划线。同法进行第三次、第四次划线。另一种为边疆划线法，是从平板边缘的一点开始，连续作紧密的波浪式划线，直至平板中央。转动培养皿180°，再从平板另一边（不烧接种环）同样划线至平板中央。划线法实质上属于一种“由点到线”的稀释法，较适用于含菌比较单一的材料的纯化，对于土壤这类微生物高度混杂的样品则较少使用。
　　以上各种分离法，都应按无菌操作进行。所用的培养基若在倒平板前，按50μg/ml的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放线菌酮（起抑制霉菌的作用），效果会更好。
　　③、培养
　　将上述接种过土壤悬液的平板倒置，于28～30℃培养，至长出菌落为止（24～36h）。
　　④、挑菌纯化
　　在平板上选择分离较好的有代表性的单菌落接种斜面，同时作涂片检查，若发现不纯，应挑取此菌落做进一步划线分离，或制成菌悬液再做稀释分离，直至获得纯培养体。
　　⑤、计数
　　选取混菌法和涂抹法中每皿菌落数30～300的平板，分别按“稀释平板测数法”中的“混合平板测数法”和“涂抹平板测数法”中的公式计数。这样求得的是每克原始土样中的活菌数，若要折算为每克干土的含菌数，还应将此数值除以干土在土样中所占的质量分数(烘干土的质量/原土样的质量)。
注：土壤含水量的测定是将一定质量的土壤在105～110℃下烘干至恒重，再称干重。
　　3、土壤中放线菌的分离与计数
　　①、土壤稀释液的制备
　　按实验“稀释平板计数法”中的方法进行，将菜园土稀释至10－5。在稀释时，可在盛无菌水的三角瓶中加10滴100g/L的石炭酸溶液和50μg/ml的制霉菌素以抑制细菌和霉菌的生长。
　　②、分离方法
　　采用稀释平板分离法，又可分为两种方法。
　　A、混菌法：按“稀释平板计数法”中的“混合平板培养法”进行，所不同者是稀释度，应采用10－3、10－4、10－5三个稀释度，各做3个重复。
　　B、涂抹法：按“稀释平板计数法”中的“涂抹平板计数法”进行，应采用10－2、10－3、10－4三个稀释度，各做3个重复。
　　③、培养
　　将上述接种过土壤悬液的平板倒置于28～30℃培养4～5d。
　　④、挑菌纯化
　　从平板中选择分离较好的放线菌菌落（应与细菌菌落区别开）较接斜面，并制片作纯度检查，若不纯，应进一步将该菌作稀释平板分离或划线分离，直至获得纯培养。
　　4、土壤中真菌的分离纯化与计数
　　①、土壤稀释液的制备
　　按实验“稀释平板计数法”中的方法进行，将土样稀释至10－4。
　　②、分离方法
　　采用稀释平板分离法。又可分为两种方法。
　　A、混菌法：按“稀释平板计数法”中的“混合平板培养法”进行，所不同的是稀释度，应选10-2、10－3、10－4三个稀释度进行接种。
　　B、涂抹法：按“稀释平板计数法”中的“涂抹平板计数法”进行，所不同的是稀释度，应选10-1、10－2、10－3三个稀释度进行接种。
　　③、培养
　　将上述接种土壤悬液的平板倒置于28℃培养3～5d。
　　④、挑菌纯化
　　从长有单菌落的平板中选取典型的真菌菌落（包括酵母菌菌落）转接斜面，并同时制片作纯度检查。若不纯，应进一步挑取该菌落采用划线分离，或制成菌悬液进一步作稀释分离，直至获得纯培养体为止。
　　⑤、计数
　　选取每皿菌落数在10～100之间的平板用于计数。不应遗漏酵母菌的菌落，必要时可制片检查，以免误为细菌菌落，具体方法见土壤中好气性细菌的分离与计数。
　　⑥、菌种保存
　　将分离到的真菌转接到PDA斜面上培养，待长好后，置于冰籍中保存，必要时进行深入研究。