蛹虫草菌种退化机理及预防措施研究进展
何晓红1 赵欢欢1 刘飞2 伍晓丽2 孙全1*
（1 重庆邮电大学生物信息学院，重庆 400065；2 重庆市中药研究院，重庆 400065）
《食用菌》2012.6
摘要 蛹虫草作为虫草资源和健康食品，已人工栽培并实现产业化生产。其菌种在继代培养过程中的频繁退化不仅导致其产量急剧下降，经济损失严重，而且直接影响行业的发展。根据前人的研究，总结、阐述其退化的形态和机理及预防措施，为规范化栽培提供一定的理论基础和指导。
关键词 蛹虫草 菌种退化机理 预防措施
蛹虫草（Cordyceps militaris），子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科、虫草属的模式种，又名北冬虫夏草、北虫草等。蛹虫草与冬虫夏草同属于真菌门虫草属，但为不同的种。其化学成分和药理作用基本相同，临床上常将蛹虫草作为冬虫夏草的替代品入药。
目前，蛹虫草已经实现人工产业化栽培，是解决野生虫草来源不足的良好途径。但是，在蛹虫草批量生产中，面临的最普遍核心技术难题就是菌种的严重退化。由于菌种退化具有可遗传性，会直接影响菌种质量，造成栽培失败，从而给批量生产带来极大的风险。解决蛹虫草的菌种退化问题已成为国内外学者研究的焦点。笔者在本实验室和前人研究基础上综述了蛹虫草菌种退化的表型和机理，并提出预防措施，以从根本上防止菌种退化，达到保持菌种优良性状的目标。
1 菌种退化表型
自然界中生物体发生变异是绝对的。随着生物由低等向高等进化，这种变异机率越来越小。如果这种变异朝着人们认为是坏的方向发展，就称为退化[1]。
退化的菌株与正常菌株有着明显的区别：退化菌株子实体原基减少，产孢能力大幅度上升或下降，培养周期变长，子实体生长受阻、生长畸形，子实体原基减少，甚至不产生子实体[1]。菌丝体色素减少，白化，甚至没有色素产生。在菌丝生长阶段，退化了的菌丝体见光之后不变色，而正常菌株在见光之后会逐渐变为橘黄色；在显微镜下两者也有明显的不同，退化菌株菌丝纤细、弯曲，孢子粘连在一起呈头状、山丘状，正常菌株菌丝挺立、粗壮，分生孢子呈念珠状[2]。另外，有研究表明退化菌株在脱氢酶活性和在色度培养基中的脱色能力方面，都明显比正常菌株弱[3]。
蛹虫草的子实体能否正常发育理论上来讲由两方面因素来决定：一是菌种的遗传背景因素，二是外界的培养条件[4]。而后者可以通过人为因素改变，使之尽可能地利于菌株的正常生长。因此，菌种遗传背景因素的改变应该是导致菌种变异的根本原因，即菌种退化的本质是染色体的变异或基因的突变。当然，不良的外界因素也可能通过引起基因突变等而导致菌种的退化。
2 菌种退化机理
目前，关于蛹虫草菌种退化的机理研究不是很多，且众说纷纭，主要有核型的改变、基因的突变、胞内有害物质的积累等等。其中，核型的改变是最多人认同的。
2.1 核型的改变 很多学者认为从蛹虫草的异核体和配型这两个方面进行研究能在遗传物质差异水平上揭示蛹虫草的退化本质。他们通过研究得出论断：蛹虫草退化的原因之一是其菌株的核相发生了改变。
蛹虫草是典型的二极性异宗配合麦角科真菌。异宗配合是一种自体不孕的有性生殖方式，即由同一有性孢子萌发形成的初级菌丝不能独立完成有性生活史，只有通过两个不同交配型的有性孢子萌发生成的初生菌丝之间的交配，才能完成有性生活史。需经过质配、核配、减数分裂等环节后，形成子囊孢子，生长形成子实体[5]。其交配型（MAT1，MAT2）由一对等位基因（MAT1-1，MAT1-2）控制，而基因MAT1-1、MAT1-2分别包含基因MAT1-1-1和MAT1-2-1[6]。
李闽锋采用随机扩增多态性DNA（RAPD）和核糖体RNA基因（rDNA）转录间隔区（ITS）序列分析发现准性生殖过程中遗传物质改变导致菌种退化。不产子实体单孢子分离株具备的是单一配型，即MAT1-1型或MAT1-2型，而所有能产子实体的菌株都具备MAT1-1和MAT1-2两个配型[7]。
谭琦等人通过PCR方法发现蛹虫草的交配型位点上存在着两类相互不同源的交配型基因，亲本菌株同时含有MAT-HMG（MAT1-2-1）和MAT-alpha（MAT1-1-1和MAT1-1-2）两种类型交配型基因为异核体，退化菌株仅含有MAT-HMG或MAT-alpha一种交配型基因为同核体。由交配型基因的类型可以鉴定蛹虫草的核相是同核体还是异核体[8]。
蛹虫草菌种退化的遗传背景原因就是核相发生了改变，即异核体变成了同核体。
2.2 基因的突变 大多数基因突变对生物的生长和发育往往是不利的，极端突变致死。食用菌细胞分裂周期和世代交替时间都很短，而细胞分裂周期越短，生长越快的物种，在生长时期发生变异的机率越大，变异个体越多，另外加上菌丝继代培养和无性繁殖的无限性，使其在自身生长过程中发生自然突变的可能性远远大于其它高等动植物[9]。蛹虫草整个生长周期为异核细胞，如果其中任一核DNA片段发生不得突变后，传代时核发生分离造成性状多样化，于是菌种出现退化，表现型性状也会随着发生变化。
李美娜等人利用PCR-RFLP和RAPD方法对野生蛹虫草及其退化菌种进行了基因水平的分析，采用了5.8SrRNA和其两端的ITS区，PCR扩增后，用限制性内切酶酶切比较优良菌种及其退化菌种之间酶切结果的差异，发现在5.8S+ITS这个区段，正常菌株与退化菌株至少有两个位点存在着差异，退化菌株在第279和第360个碱基处发生了T到C的转换，发生了碱基点突变，导致菌株退化[10]，[11]。
2.3 胞内有害物质的积累 胞内产生有害物质，当积累到一定程度，就会毒害细胞、使细胞退化，也可使遗传物质的合成受阻甚至发生突变，最终都会引起菌种的退化。而这些有害物质的产生与积累是由不良环境因子引起的。不良因子存在时，食用菌为了生存，会适应这些不良因子，会使其退回到原始状态或丧失某些优良性状，也会使菌丝细胞不能进行正常的代谢活动，进而产生有害物质，导致基因突变。
研究表明活性氧（ROS）在细胞内的过量积累是丝状真菌退化的重要影响因素之一。熊承慧等将来源于构巢曲霉的谷胱甘肽过氧化物酶基因转化到蛹虫草菌株中进行过量表达，使已退化菌株恢复子实体生长的能力，说明消除胞内活性氧可有效延缓真菌细胞氧化胁迫水平，拯救蛹虫草菌种退化的现象[12]。
2.4 菌株无性繁殖体感染病毒 病毒感染菌丝体也可能导致菌种退化。当病毒在菌丝细胞中无限增殖，就会影响细胞内正常的代谢活动，使菌丝长势下降，表达为菌丝体退化。但是一般情况下，病毒与菌丝细胞处于一种平衡稳定状态，不会出现菌种退化。只有当环境条件发生改变，这种平衡被打破，才会表现出菌种退化的现象。
郑鹏等通过构建smart cDNA文库及高通量表达谱寻找到anti-HIV病毒活性的cvn基因，通过阻止病毒与宿主细胞的结合具有抗病毒特性，蛹虫草中该基因的缺失，导致对蓝光诱导下光周期的异常应答，严重抑制其子实体的发育，致蛹虫草退化[13]。
3 防止菌种退化的方法
3.1 适宜的外界因子 环境因素特别是营养成分会影响真菌异核体核的配比及异核体的分解。另外，不良的环境因子会导致有害物质的积累而毒害菌种。因此，为了防止异核体的分解和同核体及有害物质的形成，必须选择合适的保藏及培养条件。
3.1.1 合适的保藏条件[14]，[15] ① 恒温、低温（2～4℃）保存，（且每半年活化一次，尽量缩短保藏时间不要超过一年）；② 在保藏培养基中增加0.5％的琼脂（以防止培养基中的水分大量散发，延长保藏时间）；③ 用无菌胶塞代替棉塞（既能防止杂菌的污染又能少与试管外的空气接触，避免斜面干燥，减少养分的消耗）。④ 保藏到期应予以及时转管，或用其它方法继续保藏，否则菌种极易严重退化，造成严重损失。
3.1.2 合适的培养条件 液体培养最佳培养基[16]：较好的碳源有麦芽糖、葡萄糖、玉米糁汁、红糖、甘油、蔗糖等，浓度范围以2%～5%为宜；较好的氮源有蛋白胨、黄豆粉、硝酸铵、蚕蛹、奶粉、酵母提取物，浓度范围以0.11%～0.15%为宜；较好的无机盐有KH2PO4，MgSO4·7H2O，KH2PO4，ZnCl2，浓度范围0.05%～0.1%，加入VB1和2，4-D及橄榄油均对菌丝有促进作用；最宜的培养温度为22～28℃，最适的pH为5.0～7.0，转速120～150r/min，接种量5%～10%。
固体最佳培养基：较好的碳源有小麦、大米、小米、高粱米混合物；适宜的氮源有蛋白胨[16]、黄豆粉；VB1，2，4-D，K+，Mg2+，Ca2+及植物激素对子实体的生长有促进作用，可作为生长因子；300～700lx的散射光照；菌丝体培养：温度15～18℃，湿度65%～70%；子实体培养温度17～25℃，不超过25℃，空气湿度80%～90%，最佳pH范围是5～7。
3.2 减少传代次数，防止基因突变 菌种转管次数越多，变异越大[17]。蛹虫草菌种传代、短期保藏以及菌种扩繁制种一般不超过3代。如果需要长期保藏蛹虫草菌种，则可以采用超低温恒温（0～4℃）、干燥、缺氧等显著降低菌种细胞代谢速度等的保藏方式，尽量缩短传代次数，以确保菌种质量。
3.3 及时纯化，必要时进行菌种复壮 如果已经有退化菌种，就要及时分离纯化，必要时进行菌种复壮。由于在外部形态和生理生化特征上，退化菌株与正常菌株都存在明显差异。因此，可以通过外形来及时分离出正常菌株。目前常用的复壮方法有：
3.3.1 组织分离法[18] 选择优良性状子实体，在无菌条件下用PDA进行组织分离培养，反复筛选至恢复原有性状。
3.3.2 孢子分离法[18] 选择形态好、生长势健壮并能代表该品种性状的接近成熟子实体，悬挂式采孢子于PDA固体培养基上，分离单菌落进行复壮。
3.3.3 虫体回接法[18] 将菌悬液注射到消毒的刚化蛹的柞蚕蛹体内，24～25℃培养变成僵蛹。取长满菌丝的体内组织粒到PDA斜面，分离纯化得到复壮菌株。
3.3.4 菌丝体纯化与尖端菌丝体分离法[19] 挑取健壮菌丝体顶端部分进行纯化培养复壮。
3.3.5 有性孢子分离法[19] 采用孢子收集器收集有性孢子，与亲和单核菌丝杂交成双核菌丝，分离优良菌株投产。
3.3.6 抗生素菌株复壮法[19] 活化菌株接种于一种或多种抗生素复配的PDA平板培养基上进行反复复壮培养。
另外，可以从生理生化特征上来鉴定并区分。例如：脱氢酶的活性（正常菌株的酶活性高于退化菌株的活性）[20]，[21]；溴麝香草酚蓝指示剂法（退化菌株为蓝色或绿色）[22]，提前淘汰退化菌株，减少损失，解决批量生产的核心技术问题。
综上所述，蛹虫草菌种退化现象的本质是遗传物质的严重改变，其中涉及一系列复杂的生理生化及遗传过程，主要的原因有外部和内部因素。不良的外界因子会引起异核体的分解、同核体的形成、基因突变、病毒感染以及有害代谢产物的积累，从而最终导致菌种的退化。
因此，在蛹虫草的保藏及培养过程中，务必确保最佳的外界条件，尽量防止菌种的退化。对于已出现退化的菌种，要提前鉴定、及时分离、及时复壮，以最大限度地减少大规模生产的损失。
