食用菌的菌种选育基础知识连载

第六节　原生质体融合育种

　　一、原生质体融合育种技术简介

　　原生质体是指细胞壁完全消除后余下的那部分由质膜包裹的裸露的细胞结构。原生质体融合是指通过脱壁后的不同遗传类型的原生质体，在融合剂的诱导下进行融合，最终达到部分或整套基因组的交换与重组，产生出新的品种和类型，也就是说，原生质体融合育种技术是一种不通过有性生活史而达到遗传重组或有性杂交的手段。

　　原生质体技术是现代生物技术的一个组成部分，它包括原生质体的分离、再生、融合及外源基因转化等一系列技术。利用原生质体技术可将生物细胞或去壁的原生质在离体条件下进行培养、繁殖和精细的人工操作，使其特性按照人们的意志发展，从而达到改良生物品种或创造新物种的目的。原生质体技术在动物、植物、微生物方面的研究已取得突破，并在高等植物及微生物育种中获得日益广泛的应用。20世纪７０年代以来食用菌育种工作者开展了食用菌原生质体技术的研究，表明利用原生质体技术进行食用菌育种是一种行之有效的方法。目前，平菇、香菇、金针菇、草菇等60多种食用菌原生体的分离再生技术已相当成熟。

　　二、食用菌原生质体的基本特点

　　和动物细胞不同，食用菌细胞外面包着一层坚硬的细胞壁。这一道天然的“屏障”阻挡着食用菌细胞间的彼此融合，并给各种遗传操作带来极大困难。游离的原生质体是真正的单细胞，在同一时间内能得到大量的遗传上同质的原生质体，为遗传学研究及用原生质体为材料开展食用菌育种提供可能性。它与组成菌丝的细胞相比具有以下几个特点：

　　①、原生质体超越了性细胞的一些不亲合障碍，为种内、种间、属间食用菌细胞杂交提供了融合的亲本。

　　②、原生质体能有效地摄取多种外源遗传颗粒，如DNA质粒、病毒和其它细胞器，因此，在食用菌基因工程研究及基因工程育种方面具有重要作用。

　　③、游离的原生质体除去了细胞壁的阻挡，诱变剂更容易进入细胞，是良好的诱变育种的材料。此外，食用菌原生质体也和食用菌完整细胞一样具有该菌株的全部遗传信息，在合适的培养条件下，能发育成与其亲本相似的菌株。

　　从食用菌菌丝中分离出有活性的原生质体，经再生后发育成菌落，把这种方式称为原生质体无性繁殖。食用菌原生质体无性繁殖过程也是细胞水平的筛选过程，可直接从食用菌原生质体无性繁殖后代中筛选突变菌株进行品种选育。

　　三、获得原生质体的材料

　　能够制备原生质体的材料很多，如各种类型的有性和无性孢子、单核菌丝、双核菌丝和不同发育时期的子实体组织均能获得食用菌的原生质体。但由于材料的结构、性质不同，酶解处理后获得原生质体的数量差异很大。如担孢子具有较厚的细胞壁且成份复杂不易酶解，子实体组织不易分散不能全面接触溶壁酶，而且组织化的菌丝细胞壁也较厚不利于原生质体的释放，目前主要用幼龄菌丝体制备原生质体。

　　从菌丝体制备原生质体主要有如下两个优点：

　　①、培养时间短，菌丝体生长均匀一致，进而从菌丝体中释放的原生质体，在生理和遗传特性上比较一致。

　　②、该材料在液体酶液中易分散，适宜当前用酶解的方法分离原生质体。由于不同食用菌菌丝生长速度不同，获取幼龄菌丝体天数也不同。如草菇一般需要2～3天，平菇需要～4天，香菇需要5～6天，双孢蘑菇需要7～9天，木耳则需要9～11天，菌丝体培养一般采用液体静止培养法，每瓶放十余粒玻璃珠，培养期间每天用手摇1～3次。

　　四、原生质体融合育种方法

　　1.亲本的准备

　　原生质体融合需要两株亲本，亲本必须带有遗传标记，两亲本的遗传标记必须各不相同，以便筛选融合子。目前，食用菌融合常用的遗传标记有营养缺陷型标记、抗药性标记、灭活原生质体标记、自然生态标记及形态标记等。营养缺陷型菌株和抗药性菌株的筛选在诱变育种中已介绍过。它们都是由于基因的改变而产生的表现型突变，是比较可靠的遗传标记。灭活原生质体作为标记，在食用菌中采用的也比较多，可采用物理或化学因子来灭活原生质体，使原生质体失去再生能力，仅成为遗传物质的载体，与其它原生质融合。其中化学试剂是较好的灭活因子，它能专一性地抑制原生质体上某些酶的活性，从而影响原生质体的再生能力。在灭活食用菌原生质体时常用的灭活剂有，碘代乙酸胺和焦磷酸二乙酯。物理方法灭活原生质体多采用热灭活法。自然生态标记是根据不同种、属之间，甚至种内之间的生态习性差异作为标记。生物由于生长的地理区域和生态环境不同，经长期的进化选择，都形成了独特的对生态和生活环境的适应性，这些适应性具有明显的特殊种性。如香菇中的豹皮香菇、虎皮香菇和近裸香菇，由于它们起源于热带和亚热带，对高温有较强的抵抗性，菌丝体能在32～37℃的高温范围内正常生长，而栽培香菇在这个温度范围内生长很缓慢或停止生长，这些生态习性的差异可被用来作为亲本菌株的遗传标记。

　　2.原生质体的分离和纯化

　　①、菌丝体的收集与洗涤  液体培养后通过离心或过滤收集幼龄菌丝体，然后用无菌水和渗透稳定剂(0.6M的MgSO4)分别冲洗菌丝体，用无菌吸水纸吸干多余的水分后备用。

　　②、酶解处理  按菌丝体(克)：酶液(毫升)1∶2～3，将菌丝体、溶壁酶，放入无菌的离心管内，让酶液和菌丝体充分混匀后，在合适的温度下保温酶解。溶壁酶用0.6M的MgSO4配制，保持一定的渗透压，以利质膜的稳定。酶液需预先经细菌过滤器过滤除菌，过滤膜孔直径选用0.2～0.45微米为宜。酶解温度一般28～35℃，酶解时间一般4～5h，其间每15分钟轻轻震荡一次。

　　③、原生质体的纯化 原生质体纯化的目的是除去酶液及酶解剩余的菌丝体片段。首先用纤维类物质，如脱脂棉过滤除去菌丝残片，滤液经4000r/min，20min离心，去掉上清酶液，沉淀用渗透稳定剂(0.5M蔗糖)离心洗涤2～3次，即得到纯净的原生质体。

　　3.原生质体的再生

　　原生质体在含有渗透稳定剂的再生培养基上，能重新形成细胞壁，并能发育成菌丝体，这称为原生质体的再生。原生质体在固体再生培养基和液体再生培养基上均能再生，为了获得再生单菌落，常采用固体再生培养基。再生培养通常采用双层培养基培养法，底层含琼脂2%，上层含琼脂0.7%。原生质体纯化后，要进行适当的稀释，用血球计数板准确计数每毫升原生质体的数，然后根据实际再生菌落数，便可计算出再生率。

　　　　　　　　　　　　　　每皿再生菌落数
　　原生质体再生率（％）＝ ————————　×100%
　　　　　　　　　　　　　　每皿原生质体总数

　　为了检查原生质体的纯度，纯化后的原生质体用水做系列稀释，然后涂布到不含渗透稳定剂的一般培养基上。若有再生菌落说明原生质体脱壁不彻底或有菌丝片段。原生质体的再生率与再生培养基成分、培养方法、酶解时间及离心条件有关，一般随着酶解时间的延长，原生质体的释放量增多，但由于酶对原生质体膜的破坏作用，再生率却有所下降。酶解时应以达到所需原生质体的数量为宜。较高的离心力及较长时间的离心，均可引起原生质体的破裂，一般采用2000～5000r/min、5～10min的离心条件。营养丰富的再生培养基能促进原生质体的再生，提高再生率。适宜原生质体再生的培养基可以查阅相关资料，其中1%大麦芽浸出液，0.4%葡萄糖，0.4%酵母膏，0.4%蛋白胨，0.5M蔗糖，就是一个较好的再生培养基。研究表明适当添加细胞壁合成所需的前提物质能提高再生率，例如，添加0.1%的水解酪蛋白，0.03%L－谷氨酸，能明显提高再生率。再生培养基的渗透稳定剂也是影响再生的因素，有机物质如蔗糖、甘露醇、山梨糖醇，比无机物如KCl、NaCl、MgSO4要好。渗透稳定剂通常采用0.5M蔗糖。

　　4.原生质体融合

　　原生质体融合就是把两亲本的原生质体混合在一起，在物理的(电融合)或化学的(聚乙二醇)促融作用下，诱导细胞融合。细胞融合现象最初是在动物细胞中发现的，20世纪50年代，日本学者用灭活的仙台病毒成功地诱导动物细胞融合。随后细胞融合技术逐渐扩展到植物及微生物细胞，融合方法也不断地改进和发展。目前在食用菌原生质体融合中，报道最多的是聚乙二醇(PEG)诱导融合，也有一定数量的电场诱导融合。PEG的分子量随乙二醇聚合数目不同而不同，在一定范围内，分子量越大，其促融效率越高，但毒性也越大。真菌融合常采用分子量4000～6000，动物细胞融合采用分子量1000的聚乙二醇。融合适宜pH值为7.0～7.5、钙离子浓度为0.01～0.05M，PEG的使用浓度为35%，双亲原生质体数量应保证有107个/毫升。

　　原生质体融合时将两种原生质体悬液等体积混合，5000r/min离心后弃上清液，然后用巴氏吸管使其悬浮，用巴氏吸管滴入1毫升PEG，并边加入边轻轻摇动，1分钟内加完，30℃水浴，静止促融10分钟，离心除PEG，然后稀释融合液涂布于再生培养基上进行培养。

　　5. 重组融合子的检出与鉴定

　　重组融合子检出方法包括直接检出法和间接检出法。

　　①、直接检出法：根据亲本菌株的遗传标记，直接筛选出融合子。如果两亲本菌株均为营养缺陷型标记可将融合液涂布于基本培养基上，直接筛选出融合子。若为抗药性标记，可在补充二种药物的培养基上，筛选出双重抗药性的重组子。

　　②、间接检出法：即将融合液涂布在营养丰富的再生平板上，使亲本菌株和重组子都能再生，然后，再施加选择因子检出重组子。间接法虽然费时，但它可以克服某些有表型延迟作用的遗传标记因直接选择而产生的干扰作用。

　　重组融合子拣出后，需对融合子进行进一步的。融合子的鉴定通常从以下几个方面进行综合分析：

　　①、生物学特性分析：锁状联合是食用菌种内杂交子所具有的特征，可以作为种内是否融合成功的一个标志，但作为种间融合子的标志时不完全可靠。融合子菌株与双亲菌株在遗传物质组成上有差异，因此在对峙培养时，能产生拮抗反应，也是常用的鉴定方法。融合子若能形成子实体，可对子实体特征进行鉴定以及对担孢子进行遗传分析。另外，还可对融合子菌丝体进行荧光染色，确认融合子细胞内核的数目。

　　②、生化指标分析：主要从氨基酸、DNA百分含量及同功酶谱等方面进行分析。

　　五、原生质体融合操作程序

　　程序简示如下：

　　　　亲本菌株A　　　　亲本菌株B
　　　　　　　　↓　　　　　　　↓
　　　获得遗传标记　　获得遗传标记
　　　　　　　　↓　　　　　　　↓
　　　　菌丝体培养　　　菌丝体培养
　　　　　　　　↓　　　　　　　↓
酶解获得纯净的原生质体  酶解获得纯净的原生质体
　　　　　　　　↓　　　　　　　↓
　　　　　　　　————————
　　　　　　　再生　　混合　 再生
　　　　　　　 ↓　　　↓　　 ↓
　　　　　　加聚乙二醇促融
　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　离心洗涤除去聚乙二醇
　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　融合子涂布再生
　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　融合子检出

第七节　基因工程育种简介

　　一、基因工程育种意义

　　基因工程是在基因水平上的遗传操作，它以人为的方法从某一供体生物中提取所需要的基因，在离体条件下用适当的限制性核酸内切酶切割，把它与载体连接起来一并导入受体生物细胞中进行复制和表达，从而选育出新品种。利用基因工程技术可以更方便地对更多基因进行有目的操纵，打破自然界物种间难以交配的天然屏障，将不同物种的基因按人们的意志重新组合，实现超远缘杂交，培育高产、优质、多抗新品种。基因工程育种是一种前景宽广、正在迅速发展的定向育种新技术。

　　二、基因工程的基本操作

　　基本操作包括目的基因（即外源基因或供体基因）的制取，载体系统的选择，目的基因与载体重组体的构建，重组载体导入受体细胞，“工程菌”或“工程细胞株”的表达、检测以及实验室和一系列生产性实验等。

　　1. 获取目的基因

　　取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被秤为“目的基因”。 目的基因可以人工合成，也可以用限制性核酸内切酶从基因组中直接切割得到。

　　目前获取目的基因的方法主要有三种：

　　①、从适当的供体生物包括微生物、动物或植物中提取；
　　②、通过逆转录酶的作用由mRNA合成cDNA(互补DNA)；
　　③、用化学方法合成特定功能的基因。

　　2.选择载体

　　载体必须具备下列几个条件：
　　①、是一个有自我复制能力的复制子；
　　②、能在受体细胞内大量增殖，有较高的复制率；
　　③、载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上；
　　④、载体上必须有一种选择性遗传标记，以便及时把极少数“工程菌”选择出来。目前原核受体细胞的载体主要有细菌质粒(松弛型)和λ噬菌体两类。真核细胞受体的载体动物方面主要有SV40病毒，植物方面主要是Ti质粒。

　　3. 目的基因与载体DNA的体外重组

　　即用人工方法，让目的基因与载体相结合形成重组DNA。首先对目的基因和载体DNA采用限制性内切酶处理，获得互补粘性末端或人工合成粘性末端，然后把两者放在较低的温度(5～6℃)下混合“退火”，由于每一种限制性内切酶所切断的双链DNA片段的粘性末端有相同的核苷酸组分，所以当两者相混时，凡粘性末端上碱基互补的片段，就会因氢键的作用而彼此吸引，重新形成双链。这时，在外加连接酶的作用下，供体的DNA片段与质粒DNA片段的裂口处被“缝合”，目的基因插入载体内，形成重组DNA分子。

　　4. DNA重组体导入受体细胞

　　上述体外反应生成的重组载体只有将其引入受体细胞后，才能使其基因扩增和表达。受体细胞可以是微生物细胞，也可以是动物或植物细胞。把重组载体DNA分子引入受体细胞的方法很多。若以重组质粒作为载体时，可以用转化的手段；若以病毒DNA作为重组载体时，则用感染的方法。

　　5. 受体细胞的繁殖扩增

　　含重组DNA的活受体细胞，在适当的培养条件下，能通过自主复制进行繁殖和扩增，使得重组DNA分子在受体细胞内的拷贝数大量增加，从而使受体细胞表达出供体基因所提供的部分遗传性状，受体细胞就成了“工程菌”。

　　6.克隆子的筛选和鉴定

　　把目的基因能表达的受体细胞挑选出来，使之表达。受体细胞经转化（传染）或传导处理后，真正获得目的基因并能有效表达的克隆子一般来说只是一小部分，而绝大部分仍是原来的受体细胞，或者是不含目的基因的克隆子。为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正的克隆子，需要对克隆子进行筛选和鉴定。

　　7.“工程菌”或““工程细胞”的大规模培养

　　三、基因工程育种在食用菌育种中的应用及前景

　　基因工程在食用菌育种中的应用可包括两个方面，一方面是利用食用菌作为新的基因工程受体菌，生产出人们所期望的外源基因编码的产品。由于食用菌亦具有很强的外泌蛋白能力，利用食用菌作为新的受体菌将更为安全，更易为消费者所接受；另一方面，利用基因工程定向培育食用菌新品种，包括抗虫、抗病、优质(富含蛋白质，必需氨基酸)的新品种，以及将编码纤维素或素降解酶基因导人食用菌体内，以提高食用菌菌丝体对栽培基质的利用率或开拓新的栽培基质，最终提高食用菌产量。

　　在食用菌育种中，基因工程育种研究还处于起步阶段，但发展较快。Byun将金针菇的Leu 2基因转入佛罗里达侧耳营养缺陷型，得到了转化子；Peng Ming等利用含有潮霉素抗性基因的裁体pAN7—1转化糙皮侧耳的原生质体，获得了转化子，转化率为5～46转化子/μgDNA，并建立了糙皮侧耳的转化系统。我国河北大学的燕克勤等以紫孢侧耳原生质体为受体，利用电击法将糙皮侧耳总DNA成功地导入到受体内 ，获得了具有“锁状联台”的双核转化株T1和T2，转化率为8．2×105 转化子/μgDNA ；Miranda等利用电击法将含有潮霉素抗性基因质粒pAN7－1转入双孢蘑菇，转化DNA整合到受体染色体中，在营养生长过程能够稳定的遗传，异核菌株的转化子形成了子实体，他们已建立了双孢蘑菇的遗传转化系统 。王春晖等 用PEG诱导法，将平菇DNA导入草菇原生质体，选育出菇型、酶活力及生物转化率与亲本有显著差异的菌株V157 －1。

　　基因工程育种技术是在分子水平上对食用菌遗传物质进行操作，它所创造的新物种在自然演化中不一定能出现，作为一种可控的育种手段，必将在食用菌育种中发挥重要的作用。食用菌产量、品质、抗性和耐贮等相关重要基因紧密连锁的分子标记的寻找、基因的克隆、表达与功能验证，适宜载体的构建和高效稳定遗传转化体系的建立等方面是今后食用菌育种的主要研究课题。

　　由于食用菌基因工程起步较晚，尚有许多基础性课题需要研究，如适宜载体的构建、转化体系的建立等。随着食用菌分子生物学研究的不断深入，以及基因工程研究技术的发展，人们有理由相信，食用菌基因工程育种一定会取得丰硕的成果。

第八节　野生食用菌驯化育种简介

　　随着人民生活水平的不断提高，常见的食用菌已开始满足不了市场对食用菌产品多样化的需求和日益增长的需要。市场迫切需要人们尽快推出一些食用菌新品种，以进一步促进国内食用菌产业的发展。
怎样尽快选育出既受市场欢迎的、又可进行商业化人工栽培的食用菌新品种？大自然是最好的育种专家，除了有些难以驯化的野生食用菌外，自然界中还有很多相对容易驯化的野生食用菌。

　　在自然界中，野生食用菌资源十分丰富，据统计，目前全世界已记载的食用菌超过2 000种。我国的食用菌资源也很丰富，种类繁多，现已记载的食用菌有780多种，但是目前能够人工栽培的品种只有几十种。我国国土辽阔，横跨温带、寒温带、亚热带和热带地区，气温多样、植被丰富，可以开发利用的大型真菌资源十分丰富。因此，野生食用菌驯化育种潜力很大，意义重大。

　　野生食用菌驯化育种是指有目的地选择自然界中野生食用菌，进行人工培养驯化，使之成为可以人工栽培的品种的过程。

　　由于不同的环境条件形成不同性状的食用菌品种，人们可以从中培养驯化、筛选出具有优良性状、适宜栽培的品种。

　　驯化选育野生食用菌必须符合如下几个基本原则：

　　1．子实体肥大多肉可以吃，一些枯枝落叶上的菌类一般子实体细小、皮革质，不适食用；

　　2．是木生菌（白腐菌或褐腐菌），草腐菌和粪草生菌。凡是可以人工栽培的大型真菌都可以列为研究对象；

　　3．菌根性大型真菌，即不与树木形成外生或内生菌根的食用菌，也可以试验进行人工驯化；

　　4．不是有毒的菌类。

　　5．根据联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）的要求：新食品资源的开发应符合“天然、营养、保健”的原则，也就是说在开发食用菌珍稀品种的时候，我们必须注意到，作为新食品来源的珍稀食用菌应具备三种功能（或机能）：第一，营养功能。 能给人类提供蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素类、矿质元素及其它生理活性物质；第二，嗜好功能。色、香、味俱佳，口感好，味道好，适口性强，可刺激食欲；第三，生理功能。有保健功能，食后能参与人体的代谢，维持、调节或改善体内环境的平衡，可以作为一种生物反应调节剂（BRM），提高人体免疫力，增强人体防病、治病能力，从而达到延年益寿的作用。

　　下面介绍野生食用菌驯化育种的一般步骤。

　　一、野生食用菌的采集 

　　首先，采集不同生态环境条件下不同性状的野生菌，包括优质的、珍稀的品种。

　　采集野生食用菌要注意以下几个方面：

　　①、掌握大型真菌的主要特征，识别出主要食用、药用菌及毒蘑菇；

　　②、根据不同季节采集的不同品种，了解当地的食用菌种类、分布、生长环境等；

　　③、观察食用菌与环境的相互关系、食用菌和植被的分布规律，记录当时的温度、湿度、光照强度、土壤的酸碱度（pH值）等生长条件，以便采回后人工培养驯化时模拟自然生态环境条件，设计驯化培养基和培养条件；

　　④、必要时带一套必要的采集工具，以方便采集和保存标本；

　　⑤、及时进行菌种分离，以防止有些品种不耐贮存而腐烂。

　　二、分离菌种

　　对野生食用、药用菌品种进行孢子、组织或基内菌丝分离、培养、纯化，使之形成纯菌种。相关文章本网有介绍，访客可以搜索阅读。

　　三、品种性能测定

　　为了避免浪费人力、物力，提高工作效率，首先在平板上进行拮抗反应，淘汰完全融合即编号不同，但基因型相同的重复菌株。同时在平板上对各菌株的菌丝生长速度、生长时对温度的反应等加以测定，以便于对其生理特性有初步的了解。

　　四、品比试验

　　为了比较各野生菌株的优劣，应根据实际情况选用瓶栽、压块或段木栽培等方法比较各菌株的生产性能。

　　五、扩大试验

　　品比试验后，应将试验较优的进行更大规模的试验，以对品比结果做出进一步的验证。代料栽培不得少于50m2，段木栽培不少于500根。

　　六、示范推广

　　经扩大试验后对选出的优良菌株有了更明确的认识，但在大量推广之前，应选取数个有代表性的试验点进行示范生产，待结果得到进一步确证后，再由点及面，逐步推广。

　　现阶段，中国珍稀食用菌研究工作主要集中在育种与栽培技术方面。为了使珍稀食用菌能得到持续健康地发展，除了继续加强育种与栽培技术研究之外，今后必须加强生物学特性、遗传学特性、生理生化、乐动体育nba 技术、产品保鲜与深加工技术、栽培技术标准化方面的研究。

　　大力驯化育种珍稀食用菌，对于改善食用菌产业的结构，进一步繁荣食用菌产业，促进各地经济发展具有十分重大的意义。