草菇菌种的提纯复壮初探

王志强
上海农科院食用菌所 农业部食用菌遗传育种重点开放试验室 上海市农业遗传育种重点试验室，上海闵行
《食用菌》2009.6

　　菌种的分离与筛选是在乐动体育热门赛事 过程中的重中之重。食用菌的菌种在使用过程中存在着变异与退化，尤其是草菇菌丝，生长快退化也快，因此要定期引种或提纯复壮，才能保证菌种质量及种性稳定，从而为最终产量稳定打下基础。

　　1  组织分离

　　工厂化生产草菇时，为了保证种性稳定，大多采用定期组织分离、严格筛选，获得菌种。一般每次选择种菇时，首先要选择出菇好（产量高，整体菇形大小适中，整齐度高）的菇房，菇房内无明显病虫害；其次在此菇房内选择出菇最好的床架，从该床架中挑选出菇最好的料层；在该料层上最好的一片菇中选择无杂菌虫害、生长健壮、非常结实、底盘肥大的草菇幼菇（五六分熟，呈小水蜜桃状）3～4个。采下幼菇立即放入无菌或洁净的塑料袋中，连同分离用的试管培养基带到菌种室超净工作台。

　　组织分离时，先用75%的消毒酒精消毒双手和工具以及种菇表面（操作熟练者也可不消毒种菇表面），用充分灼烧的手术刀先在纵面上浅浅的环切一道（不要切破外菌幕），在种菇的基部从正中切开一个小口，用手捏种菇外部剥开菇蕾，在菇盖与菇柄交界处用灭过菌冷却后的手术刀浅切一个“田”字形，每个小块3～4mm见方（尽量不要划穿菇肉触及菌褶），直接用刀将菌肉小块接入试管培养基上，塞上棉塞。将菌肉小块拍到试管底部，置于29～31℃环境培养。分离到的试管要达到24支左右，如因操作失误而达不到此数量，要补充合格种菇再分离。

　　2  分离菌株的鉴定与筛选

　　2.1  初筛1 

　　①一般分离培养3d左右菇肉上萌发出白色菌丝，此时挑出因操作不过关而导致斜面感染杂菌的试管，余下继续培养；
　　②待菌丝长至2cm左右时，观察菌丝生长情况：a基内菌丝整齐浓密，纤细有力呈银灰色，生长速度快；气生菌丝爬壁能力强，长势整齐一致的继续培养；b.基内菌丝很稀疏，气生菌丝长势混乱，气生菌丝发白，气生菌丝远比基内苗丝多或者感染杂菌，只要出现其中一种情况就剔除；
　　③观察满管快慢，标注满管时间；
　　④观察厚垣孢子出现早晚，标注时间；优先选择先满管先出现厚垣孢子的试管，留最好的12株，不足则有多少留多少。

　　2.2  初筛2 

　　①将剩余的12株编号VZl～VZ12，取尖端菌丝转管，底部3cm不动，每支转20～30支，对应标注VZlMI～VZ12M1；
　　②转管后剩余的菌种，在酒精灯下，敲破试管底部 （可用小砂轮沿底部无培养基处用力划出痕迹，然后在火焰上稍稍烤一下，如未破裂，迅速用冷的酒精棉球冷却可使试管底部破裂），用灭过菌的打孔器在底部1～2cm位置打孔取样（打孔器直径4～5mm），打2排孔，每排2个；靠基部的那排接到平板中央，另一排接到平板边沿；菌丝面贴培养基，标注与转管试管相同，置于29～31℃倒置培养；
　　③转管试管的筛选方式与下述“草菇母种转管筛选”相同；平板分2块：接在中央的菌种，主要对比菌丝形态，色泽、均一度，是否存在角变，淘汰不稳定的菌株；接在边沿的菌株，主要比较每组的平均生长速度，如果平板的盖板无冷凝水的，比较其爬壁力；综合评比后，筛选出最佳的8株。

　　2.3  复  筛

　　①待厚垣孢子出现后，将筛选出的8个菌株的试管置于20℃下避光保藏；
　　②8株菌株挑最好的1～2个平板接原种，离接种块2cm处打孔取样，每个样接1袋原种，菌丝面贴料面。每个菌株接30袋，29～31℃避光培养，记录其生长速度、观测菌丝色泽及长势（原种培养基须按配方精确称量，严格控制料水比，拌料均匀，装袋重量、高度、松紧度一致）。
　　③筛选出表现最佳的4个菌株，每个菌株挑最好的20袋原种，5袋置于20℃避光保藏，15袋进行出菇试验。

　　3  出菇试验

　　出菇试验对于所有食用菌的育种都是最关键的一步，通过出菇试验比较不同菌株之间的优劣，筛选出不同菌株适合的生产模式。

　　草菇组织分离平板接原种的同时，外来引种经转管筛选后的母种，每个菌株接30袋原种；当厚垣孢子都出现后，每个菌株挑出较好的15袋做出菇试验。
　　①4个菌株加外来引种各 15袋，每个菌株每组5袋，3个重复；
　　②沿底部折角割去袋底，袋口留2cm，多余割去，排在菇床架上；
　　③喷出菇水：出菇水的温度、pH值与正常出菇水相同，总水量约为原种干重的30%，喷完出菇水后盖无纺布进入催蕾环节；出菇水根据实际情况调节，做到底部不滴水，宁少勿多，防止因水分过多造成大幅度减产。
　　④催蕾及出菇管理与常规同，采收记重时记录每组的采收时间和采收菇重，统计分析时每组剔除1袋最差的，其余统计分析比较平均生物转化率、开始出菇时间和清床时间；保留生物转化率最高、周期最短的2个菌株；淘汰的菌株对应的保藏原种停止保藏，保留的2个菌株对应的保藏原种在有效期内轮流转扩栽培种投人生产。

　　4  草菇母种转管筛选

　　转管前要将种源在29～31℃的环境下培养24～48h，转管时要做到空白斜面无冷凝水，接种块大小一致，规格3mm×3mm～4mm×4mm，菌种块直接掉到底部，不要在培养基上划过，29～31℃环境下避光培养。
　　①接种后24h，观察萌动情况，正常12h萌动；
　　②接种后48h，观察菌丝生长情况：a基内菌丝整齐浓密，纤细有力呈银灰色，生长速度快；气生菌丝爬壁能力强，长势整齐一致的继续培养；b基内菌丝很稀疏，气生菌丝长势混乱，气生菌丝发白，气生菌丝远比基内菌丝多或者感染杂菌，出现其中一种情况要剔除；c相对a而言，生长速度略慢，标注后对比培养（有些种块在接种时烫伤而萌动慢造成的，后期培养指标合格可以使用）；
　　③接种后72h，观察气生菌丝的爬壁能力，将爬壁能力较弱的剔除；
　　④接种后84～120h，正常菌丝满管，比较检查时要将培养不同天数满管的标注并分开（分成3类）；培养144h未满管的剔除；
　　⑤接种后156～240h，正常菌丝出现砖红色厚垣孢子，每天检查，出现厚垣孢子后，标注出现日期，当天放置到18～22℃环境避光保存（保藏时将不同天数满管的分开放）；培养240h未出现厚垣孢子的剔除。

　　注：斜面母种在30d有效保藏期内使用的，对于同一批次同一品种的，优先使用菌丝先长满的；在菌丝同一天长满的里面优先使用先出现厚垣孢子的。

　　5  原种和栽培种的筛选

　　生产原种和栽培种之前，在接种前48h，取出保藏菌种置于29～31℃下恢复培养。
　　原种的筛选标准：以生长速度、菌丝色泽和健壮程度、厚垣孢子出现早晚为基准；采用标准棉子壳配方29～31℃培养，一般48～72h封面，8～10d长满，12～15d出现厚垣孢子，10d内未长满的淘汰；菌丝纤细有力呈银灰色的保留，菌丝变浓白或局部变浓白的的淘汰；由于配方以及含水量的不同，上述参数会有所不同，根据实际情况选择菌丝外观好生长速度快的原种，出现厚垣孢子早的更好。

　　栽培种的筛选与原种基本相同，差异在时间上，一般使用标准配方在29～31℃培养，48h封面，7～10d长满，11～14d出现厚垣孢子，10d内未长满的淘汰。

　　6  菌种保藏期限

　　草菇母种出现厚垣孢子之后立即置于18～22℃环境避光保藏，30d内使用最佳，最长不超过60d，草菇原种出现厚垣孢子之后立即置于18～22℃环境避光保藏，20d内使用；草菇栽培种出现厚垣孢子之后最好立即使用，18～22℃下保藏前3天效果最佳，最多存放7d。

　　注意事项：

　　①在草菇上使用的试管培养基，要注意以下几点：
　　a.培养基在配制至分装前，做到搅拌均匀，防止因试管内营养差异影响对菌丝优劣的判断；
　　b.试管培养基灭菌后冷却、摆斜面时要防止出现大量冷凝水，培养基温度在55～60℃的时候出锅，温度过高冷凝水多，温度过低容易凝固；斜面摆好后要立刻覆盖一些洁净的保温材料，防止凝固时产生大量冷凝水；如果少量定型的斜面存在冷凝水，应剔除；如果大多数试管都产生冷凝水，可在较密闭的干净箱体内放置干燥剂（如生石灰块）对试管进行干燥，待斜面上冷凝水除去后立即停止干燥。
　　②际准草菇菌种配方：棉子壳84%，麸皮12%，轻质碳酸钙2%，生石灰2%，料水比1∶1；灭菌后pH≤6.0。根据棉子壳的质量优劣，酌情添加1%蔗糖。
　　③周期的安排：在各个环节都稳定的情况下，一般组织分离、出菇试验90d做一次，如果出现高产菇房，立即做组织分离和出菇试验。一次组织分离到出菇试验结束需要40d，每次接试管到出现厚垣孢子需要7～10d，每次转管出现厚垣孢子保藏20d需要进行下1次转管（每次转管的尽量在保藏1个月内使用），允许转管3次。