野生紫灵芝S2组织分离与出芝试验研究
钟礼义
（福建省武平县食用菌站，福建武平 364300）《食用菌》2012.3
摘要 在梁野山自然保护区采集到4株（编号S1、S2、S3、S4）正在生长的天然野生灵芝，通过组织分离→菌丝尖端提纯→出菇试验→品比试验，以当地主栽品种为对照，筛选了产量高、抗逆性强、朵形美观的的紫灵芝S2新菌株。
关键词 野生灵芝 组织分离 试验研究
1 材料与方法
1.1 供试菌株S1、S2、S3、S4为武平县梁野山野生分离菌株，X5（CK）为武平主栽品种。
1.2 供试培养基
1.2.1 母种培养基 马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH6.5。
1.2.2 原种及栽培种培养基 杂木屑70%，麸皮25%，玉米粉3%，石膏粉1%，蔗糖1%。均按常规方法制作，pH值自然，含水量55%-60%。
1.3 试验方法 试验地点在武平县下坝乡露冕村。
1.3.1 组织分离 将所采集到的4株野生灵芝带回试验室，用无菌水快速冲洗后用无菌纸吸干，再用75%酒精作表面消毒后与准备好的20mm×200mm试管PDA斜面培养基及分离接种工具一同放入接种箱内消毒30min，按无菌操作要求挑取0.1-0.2cm白色组织块，接种于PDA斜面中央，进行组织培养。每株野生灵芝（S1、S2、S3、S4）分离5支试管。经过尖端提纯3次后进行菌丝长势比较。
1.3.2 室内筛选 将获得的有效菌株进行菌丝耐温培养、菌丝长势和形态观察等试验，剔除菌丝长势弱的菌株。
1.3.3 出芝试验 出芝试验是鉴定所分离的菌株是否是灵芝菌株最直接的鉴定方法。2003年12月-2004年9月将所分离优选后的4株野生菌株S1、S2、S3、S4进行短段木熟料栽培试验，每个菌株栽培150kg菌材（30袋，每袋约5kg菌材）。试验证明所分离的4株菌株为灵芝菌株。
1.4 试验设计
1.4.1 稳定性观察 选用野生菌株S1、S2、S3、S4栽培子实体组织分离，提纯后进行连续10次传代转管培养，每株转5管，置于25℃恒温培养。观察记载菌落特征、菌丝长速、长势等。
1.4.2 抗逆性 ① 温度适应性：将供试菌株接入PDA平板（90mm）培养基，接种块的菌丝面朝上，放于25℃恒温箱培养，当菌落直径长至1cm时，在菌落边缘画线作为生长起始线。随后把这些培养皿分别置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃下培养，每个处理5皿，将生长最快的温度下的培养皿即将长满时取出，在菌落边缘再画一终止线，用尺子测量起始线与终止线之间的距离，计算菌丝生长速度，取平均值，从而获得菌丝生长最适温度。把不能生长的培养皿移到适温下培养4-7d，可继续生长的原所处温度为限制生长温度，不萌发的培养皿处的温度为致死温度。②pH 值适应性：用0.5mol/LHCl或0.5mol/LNaOH进行调酸碱度试验，记录调到两个装酸碱度（pH值）为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0所需的HCl或NaOH的量，然后对各个三角瓶培养基进行调酸碱度，随后立即制成平板培养基，接入供试菌株，置于25℃恒温箱培养，当菌落直径长到1cm时，在菌落边缘画线作为生长起始线，继续培养，当生长最快的pH下的培养皿即将长满时取出，在菌落边缘再画一终止线，用尺子测量起始线与终止线之间的距离，计算菌丝生长速度，取平均值，从而获得菌丝生长pH范围和最适pH。每个pH处理5个重复。③ 品比试验：将所分离优选后的4株野生菌株S1、S2、S3、S4进行短段木熟料栽培扩大试验，以当地主栽品种X5为对照，以米槠木材加工后的边料为栽培材料，选用板宽3-20cm，材质新鲜且多带树皮，含水量40%-45%，截成28-30cm长待用。每个品种1100kg（220袋，5.0-5.5kg/袋，1100kg菌材折1m3），装袋灭菌后接入不同的等量菌种，待菌材培养成熟后进行覆土栽培。每个菌株栽培试验量220袋菌材，每55袋分为一个组，设4次重复，采收时计算每小区产量，以总产量作比较。观察记载不同菌株的母种、原种及栽培种菌丝生长速度及长势。观察不同菌株的子实体菌柄、菌盖生长时间，孢子粉弹射期及产孢量，采收期，采收后晒干统计产量和计算折干率。
2 结果分析
2.1 稳定性 观察表明：S1、S2菌株转管4次后，长速始终稳定并有加快趋势，菌丝白色，纤细整齐，匍匐生长，略有爬壁；S4长势基本稳定；S3菌丝较稀疏，稳定性较差。
2.2 抗逆性
2.2.1 温度 从表1可以看出两个菌株的菌丝生长温度范围8-35℃，最适生长温度25-30℃。
表1 紫芝S2与X5（CK）菌株在不同温度下的菌丝生长速度比较（cm/d）
菌株 10℃ 15℃ 20℃ 25℃ 30℃ 35℃ 40℃ 45℃
S2 0.22 0.28 0.55 0.83 0.68 0.26 0 0
X5 0.22 0.23 0.50 0.75 0.54 0.25 0 0
2.2.2 pH值 从表 2 可知两个菌株适宜 pH 4.0-6.0。
表2 紫芝S2与X5（CK）菌株在不同pH下的菌丝生长速度比较（cm/d）
菌株 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
S2 0.51 0.58 0.52 0.32 0.21 0.06 0
X5 0.53 0.55 0.50 0.40 0.16 0.04 0
2.3 不同野生菌株菌丝生长比较（表3） 菌种培养试验结果表明：供试的5株菌株菌丝白色、匍匐生长，尖端整齐，略有爬壁，长势好。S1、S2、S4菌丝长速较快，在试管PDA斜面培养基上9d长满；其次是S3、X5，在试管PDA斜面培养基上10d长满。在原种和栽培种上长速最快的是S1和S2，25d满瓶（袋）；其次是S3、S4，26d满瓶（袋）；X5长速最慢，27d满袋，但菌丝较粗壮。
表3 不同灵芝菌株菌丝生长速度与长势比较
菌丝长满瓶时间/d
菌号 母种 原种 栽培种 菌丝长势（栽培种）
S1 9 27 25 菌丝白色、生长旺盛、长势有力、尖端整齐、长速较快
S2 9 25 25 菌丝较白、粗壮、较密、生长势好、尖端整齐
S3 10 26 26 菌丝较白、稀疏、纤细、长势一般
S4 9 25 26 菌丝较白、密、粗壮、尖端整齐
X5 10 28 27 菌丝白色、较粗壮、浓密、生长较慢、尖端整齐
2.4 子实体产量及形态特征 品比出芝试验（表4）中表明：产量最高的是S2菌株，平均产量25.36kg/m3，对照菌株X5产量23.12kg/m3，比对照增产9.69%。S1产量居第二，当年平均产量23.84kg/m3，比对照增产3.11%。S3、S4两个菌株产量均低于对照X5，分别减产8.09%和11.42%。产量依次为S2＞S1＞X5＞S3＞S4。
表4 不同灵芝菌株特征与产量比较
子实体 菌盖直 菌盖中心 菌柄长 菌柄直 当年平均产
菌株 色泽 径/cm 厚度/cm 度/cm 径/cm 量/(kg·m3) 位次
S1 紫黑色 5-20 1.0-2.12 5-15 1.0-1.5 23.84 2
S2 紫褐色 8-30 1.25-2.53 5-15.9 1.2-2.1 25.36 1
S3 紫黑色 9-22 1.15-2.0 5-10 1.0-1.5 21.25 4
S4 紫黑色 5-26 1.15-1.8 5-14 1.2-1.5 20.48 5
X5(CK)紫褐色 5-28 1.12-2.35 5-12.35 1.2-1.8 23.12 3
X5子实体生长时间较长，产孢期较长；S2、S3生长时间与产孢期较为接近（表5）。不同菌株的菌盖菌柄中生，少数偏中生，均有似漆样光泽。
其中，供试菌株（表4）菌盖多为圆形或近圆形，极少呈心形，S1、S2、S3、S4为紫褐色至紫黑色，菌盖略薄但较硬实，表面平整，皮壳较光亮（擦去孢子粉后），中间稍凹陷，同心环纹较疏，放射状纵皱明显；多数直径在12-21cm，中心厚1.0-2.53cm；菌柄中生，少数侧生，柄长5-15.9cm。
表5 不同灵芝菌株子实体生长发育时间（d）
菌号 S1 S2 S3 S4 X5
菌柄生长期 18-22 15-20 15-20 20-25 25-30
菌盖生长期 22-26 20-25 20-25 20-25 30-45
子实体生长期40-48 35-45 35-45 40-50 55-75
产孢期 15-20 15-20 15-20 15-20 18-22
图1 灵芝S2菌株出芝场景
X5（CK）（表5）菌盖为近黑色，菌盖厚但较为松软，表面略为不平整，漆状光泽明显，同心环纹细密均匀；多数直径为15-27cm，中心厚1.12-2.35cm；菌柄中生，少数侧生，柄长5-12.35cm。随机抽取供试灵芝鲜子实体1kg，将其烘干至恒重，折干率在41.5%-45.67%，其中S1折干率为41.5%，S2折干率为45.67%，S3折干率为42.6%，S4折干率为41.5%，X5（CK）折干率42.15%。
3 小结与讨论
出芝试验证明：从野生灵芝中所分离的4株菌株子实体形态与野生灵芝形态相符。分离菌株菌丝在pH4-6范围内生长良好，最适pH为4.0-6.0。温度范围8-35℃，最适生长温度25-30℃。
栽培产量最高的是S2菌株，当年平均产量25.36kg/m3，对照菌株X5产量23.12kg/m3，比对照增产9.69%。S1产量居第二，当年平均产量23.84kg/m3，比对照增产3.11%。S3、S4两个菌株产量均低于对照X5，分别减产8.09%和11.42%。产量依次为S2＞S1＞X5＞S3＞S4。
形态特征：菌盖多为圆形或近圆形，极少呈心形，S2子实体紫褐色，S1、S3、S4紫黑色，均有似漆样光泽，菌盖直径5-30cm，中心厚1.0-2.53cm；菌柄中生，少数侧生，柄长5-15.9cm。
为筛选优良菌株，有待进一步做多点试验。
