微生物的三种培养方法及其在食用菌生产中的应用

李长喜1 李巨2 龚凤萍1
（1河南信阳市农科院，河南信阳464000；2信阳农业高等专科学校，河南信阳464000）
作者联系电话：13837607555
《食用菌》2013.5

　　摘要 综合分析论述了微生物纯培养法、选择性培养法和优势培养法的基本原理，以及在食用菌生产中的应用效果。特别是优势培养法的应用，它解决了施用化学药物所造成的接种环境恶化问题。
　　关键词 消毒 灭菌 纯培养 限制 抑制

　　微生物的培养方法有三种，即纯培养法、选择性培养法和优势培养法。现将这三种培养方法的基本原理及其在食用菌生产中的应用叙述如下，供作参考。
　　1 纯培养法
　　1.1 基本原理 系在灭菌彻底的基质上，严格实施无菌操作技术，杜绝杂菌污染，接种目的菌，并通过培养获得发菌成功的一种方法。应用这种方法，即使所接种的目的菌在基质上生长很慢或不能生长，也不得有杂菌发生〔1〕。
　　这种方法强调在无菌条件下操作接种，因此要求对接种环境进行严格消毒，并要求接种人员穿工作服，戴工作帽，以配合无菌操作，杜绝杂菌污染。达到无菌操作的主要设备是接种箱、接种室、酒精灯等。
　　1.2 在食用菌生产中的应用 这种方法主要应用于纯菌种分离，母种、原种、栽培种的制种，以及液体菌种的制种。生产中的菇组织分离、耳片分离，以及段木栽培菌棒木组织分离，都要求应用纯培养法。
　　1.2.1 菇组织分离法 平菇、香菇、真姬菇、双孢蘑菇等伞菌均可应用这种方法。作法是无菌操作，在无菌条件下撕开菇体，于无杂菌的撕面上用灼烧灭菌的利刀冷却后，切取米粒大小的组织块转接到基质上，培养得纯菌种。
　　1.2.2 耳片分离法 多用于黑木耳和毛木耳。作法是选择肥厚的鲜耳片，无菌操作，在无菌条件下用母指和食指滑动其背面和腹面，揭开后于无杂菌的揭面上，用灼烧灭菌刮刀冷却后刮取米粒大小的胶质耳肉转接到基质上，培养得纯菌种。
　　1.2.3 木组织分离法 应用于段木香菇、段木黑耳和段木银耳的纯菌种分离。菇木或耳木分离的取样要求其丰产性好，无其它木腐性杂菌发生，确认仅有所栽培的菇、耳菌丝吃入段木，才能选作分离的样本。取样方法是于段木的中段，截取带有一个菌穴的一段，长10～15cm，用刀劈掉约1cm厚，余下木质部分备用。
　　香菇、黑木耳的分离，要求无菌操作，在无菌条件下用灼烧灭菌的利刀将分离样本撬掉一层，于无杂菌的撬面上，再用灼烧灭菌的刀片切取米粒大小的木组织转接到基质上，培养得纯菌种。
　　银耳菌种系由银耳、香灰菌两种菌交合制成。根据银耳菌较香灰菌耐旱性强的生理特性，笔者对香灰菌的耐旱程度作了观测比较，结果是在豫南气候条件下，6月上旬截取分离样本，在室内常温下干藏133d香灰菌死亡；在电热恒温箱内32℃干藏42d香灰菌死亡。香灰菌死亡后，样本中仅留银耳菌。根据这一观测结果，笔者采取木组织分离法，样本取回后，先于远离菌穴处将香灰菌分离出来，尔后作干藏处理，待香灰菌死亡后，再于近菌穴处将银耳菌分离出来。分别分离出的两种菌株，其表现优劣不一：分离出的银耳菌落略凸起，继而出现白毛团，并逐渐胶质化者为佳；香灰菌长势旺，能产生色素，表现黑绿色者为佳。待分别优选后进行交合，制成交合菌种，并经出耳试验认可后应用于生产。
　　2 选择性培养法
　　2.1 基本原理 不同种类微生物所需要的培养条件不尽相同，据此，人为提供某些条件抑制杂菌发生，而接种的目的菌又能正常生长，从而获得其培养成功的一种方法就称为选择性培养法[1]。实施这种方法防治杂菌发生，靠的是限制条件的作用，不强调环境消毒和无菌操作接种。
　　2.2 选择性培养法在食用菌生产中的应用 这种方法的应用要求对所接种的目的菌，以及主要种类杂菌的生理特性有所认识，并以此作为提供选择性条件的依据。这些条件包括温度、pH值、吸氧方式、基质养分组成、基质处理、化学药物等选择性的利用。
　　2.2.1 温度选择性的应用 白灵菇、金针菇、杏鲍菇、香菇、平菇等低温型菇类，在偏低温（5～10℃）下接种培养，既能缓慢发菌，又能限制适温偏高的杂菌发生；草菇属高温型食用菌，在35～40℃下能正常发菌，而在此高温下却限制了多种杂菌的发生。
　　2.2.2 pH选择性的应用 平菇能耐受偏高的pH，据试验，栽培配料石灰用量加大到5%仍能正常发菌、出菇，而却限制了多数适宜微酸性杂菌的发生；同样草菇对pH的耐受性更强，栽培配料加大石灰用量，也能收到限制杂菌发生的效果。
　　2.2.3 吸氧方式选择性的应用 以蜜环菌为例，其菌丝体具有输导氧气的生理特性，据此，笔者采用“隔水法”制备用于栽培天麻的蜜环菌栽培种，收到了防治杂菌，发菌成功率高的效果。其方法是，基质配料时加水量达到饱和，并使料面有一薄水层，深层缺氧，灭菌后接种，使菌种块陷入基质，稍有外露。这样通过其外露部分输导氧气，深层发菌正常，并限制了杂菌的发生；即使其表面透气性好，有杂菌发生，则深层均为蜜环菌的菌索，无碍生产应用。
　　2.2.4 基质养分组成选择性的应用 香菇菌丝具有产生木质素、纤维分解酶，能以分解利用大分子物质，而多种杂菌必须在含有低分子物质的基质上才能发生。据此，试验采用纯木屑基质开放式接种香菇，结果30d左右发菌满袋，而无杂菌发生[1]，[4]。
　　这一选择性条件的应用还需做到两点：一是用于种菇的林木与其它各种植物一样，在生命活动中均能产生抗病物质而具有抗病性，即抗多种病菌，也有碍食用菌发菌。因此，新砍林木打出的木屑，必须处理后才能用于种菇。处理方法是将其存放一年以上抗菌物质会自然消失，或将其加水调制后常压100℃持续1h使抗菌物质消失。二是香菇品种的选用，当前生产中应用的香菇品种，在长期人为培育驯化过程中，多数酶活性减弱。因此应用此法必须选用酶活性强的品种。经试验筛选，能在纯木屑基质上发菌的有Cr02和Cr132两个品种，笔者应用的为Cr02[4]。
　　2.2.5 发酵料选择性的应用 种菇（耳）原料加水调制，在多种自然微生物活动作用下，发酵质量达标后就增强了基质的选择性。在这样的基质上，杂菌已不能发生，而接种菇（耳）发菌正常。其应用方式可一次性发酵后即接种发菌，或先发酵，而后再蒸成熟料接种发菌。这里所提到的蒸料系常压100℃蒸4～5h，作用并非灭菌，而是使原料熟化和灭虫，其限制杂菌发生的作用仍为发酵。
　　2.2.5.1 发酵料栽培双孢蘑菇 通过前发酵和后发酵两步操作实施。前发酵堆温控制在65～75℃，其间翻堆4～5次；后发酵控温为60～65℃，保持5～6h。如此处理可杀死多数残存线虫、螨类和有害杂菌营养体，增强双孢蘑菇生产的稳产性。这项技术在蘑菇生产中已普遍推广应用[2]。
　　2.2.5.2 发酵料栽培平菇 一次发酵后接种和先发酵后蒸料再接种，两种方式在河南均有应用。一次性发酵技术掌握，起堆要松，在好氧条件下发酵，堆温升至65～75℃时翻堆，持续时间6～7d，其间翻堆4～5次；发酵质量要求上下内外均匀一致，气味脱臭，料色略透棕红，手握有弹性，透气性好，接种后表层深层发菌基本一致，无杂菌发生。先发酵后蒸料再接种，其发酵时间和翻堆次数均减少一半，省工省时，产菇量和菇体品质均优于一次性发酵法。近年来在豫南菇农中已迅速推开，一般种菇大户年投料25t出菇可获纯利10万元左右。
　　综合比较评价发酵料的应用，与生料相比，它解决了生料适宜接种期太短、杂菌难于控制，稳产性太差问题；与灭菌料相比，它解决了基质灭菌的高耗能问题。但它所带来的问题是，产菇量和菇体品质均赶不上生料和灭菌料栽培。究其原因是，基质的发酵过程是干物质的消耗过程，而且所损失的又多为营养价值高的成分，这就等于减少了种菇的投料量，产菇量势必降低；菇体质量变差的表现是，其质地韧性变差，易开裂，不耐贮运，品尝食味变淡。目前菇农中已有灭菌料平菇上市，且是优质菇，比发酵料产品价高出2元/kg左右。这都是发酵料应用中有待进一步研究解决的问题。
　　2.2.5.3 发酵料栽培毛木耳 目前河南袋栽毛木耳均应用基质先发酵后蒸料的生产方式。耳农评价，这种方式与生料灭菌相比，灭菌时间短，节能、省工、省时，并解决了杂菌为害问题，稳产性好。
　　2.2.6 化学药物选择性的应用 目前生产中应用的多为多菌灵类化学药物拌料。就应用效果而论，市售化学农药均要求持效期短、低残留，因此，用其拌料后所获产品，经化验分析，无药物残留问题。生产中用于拌料栽培平菇，药物拌料后可收到防治杂菌的效果，特别对绿霉特效，而平菇仍能正常发菌出菇。对袋栽香菇、金针菇、白灵菇、真姬菇等系灭菌料接种，不宜应用这种方法。常压灭菌时间长达25～30h，在此过程中，拌入的药物就会失效而不能发挥作用。
　　3 优势培养法
　　3.1 基本原理 系人为提供适宜条件，促使接种的目的菌早生快发，抢先占居料面优势，抑制杂菌发生，不再强调环境消毒和无菌操作，实施开放式接种的一种方法[2]。
　　3.2 提出这种方法的依据 结合生产实际，从生产需要出发提出了这种方法。
　　当前我国食用菌生产中的一些技术操作方式就不能避免杂菌污染，如打穴手掰菌块接种，以及菌棒松扎口、折掖封口接种等，均会因手指与菌料接触或通气增氧发菌而带进杂菌造成污染。对杂菌既然堵的办法行不通，只有另求它法，就是允许杂菌污染，而不允许其发生。
　　长期以来，在食用菌生产中过分强调环境消毒、无菌操作，大量用药喷洒、熏蒸消毒，导致接种环境恶化，有碍人身健康和接种技术的实施，接种人员迫切要求解决这一问题。
　　据试验，任何化学药物消毒仅能部分杀死杂菌，如甲醛熏蒸24h，杀菌力76%，30min仅为24%[2]。
　　杂菌污染、发生、为害是三个不同的概念，有污染不一定会发生，即使发生也有为害轻重的差别。因此，杂菌污染后，将其控制到不发生、不为害的程度是可行的。
　　3.3 实施优势培养法的必须条件 应用这种方法，简化了生产技术，但不能理解为可以粗放对待，它要求必须具备四个条件。①基质灭菌要彻底，袋子不得有微孔。②选用优质菌种，要纯，适龄，基质配方合理，活性好；用于打穴接种的菌种，如香菇菌种，要能手掰成块，不得松散。③加大用种量，严格掌握接种方法，原则是菌种能基本覆盖基质料面[3]。袋栽香菇打穴接种，将菌种掰成长块，接入菌穴，按压密接不悬空，并压下穴孔周边薄膜；金针菇、白灵菇、真姬菇等短棒栽培，松扎口或折掖封口，通气培养，接种操作，要扒碎菌种接入，基本布满料面；短棒栽培，用套环插入接种棒灭菌，接种时拔出接种棒，将扒碎的菌种接满接种孔，接种后加棉塞。④接种后给以适宜的发菌条件，特别是温度条件，促菌早生快发，占居料面优势，抑制杂菌发生。
　　3.4 选择性培养法与优势培养法的联合应用 笔者曾研究成功代料香菇的两步栽培法。此法的成功就是选择性培养法与优势培养法联合应用的结果[4]。
　　此法选用香菇品种Cr02，第一步应用选择性培养法，当年砍树打出的木屑，纯木屑加水调制后常压蒸1h，9月15日开放式接种，30d发菌透料，无杂菌发生。第二步于第一步发菌透料后将菌棒掰成碎块，开放式加入小分子物质麸皮20%，蔗糖1%，在香菇菌丝占居绝对优势的条件下，7d左右达到恢复发菌结块密实，无杂菌发生。试验结果是，经两步处理的菌块出菇采收期3月7日-10月6日，生物学效率92.9%，而未作第二步加料处理的菌块出菇采收期推迟至5月7日-11月9日，生物学效率仅26.2%。
　　3.5 优势培养法的生产应用示范效果 此法提出后，曾在全省进行多点示范推广，普遍收到菇农的好评。
　　浉河区点一个山区村，2000年发展春栽香菇，在种户中推广优势法，与应用熏蒸消毒而后接种的方法相比，制棒成功率并无差别，均在95%以上。近年来该村香菇种植面积已稳定在150万棒，平均每户1.5万棒，获利3万元，帮助山民走上了一条脱贫致富路。
　　郑州北郊点2002年早春，应用优势法生产白灵菇菌棒20万棒，松扎口在棚内开放式料面接种，制棒成功率接近100%。这批货发出后已到5月上旬，该种户又生产一批菌棒，结果全部发生杂菌以失败告终。究其原因就是气温已高至白灵菇这一低温型菌不能发菌定植的程度，而却适宜于杂菌的大量发生。
　　淮滨点2008年入冬至开春发展袋栽毛木耳，短棒，基质生料灭菌，几户共生产18万棒，松扎口料面接种。首批试种的2000多棒，室内熏蒸消毒后接种，在此低温季节，培养室温仅8～10℃，满足不了毛木耳这一中温型菌的要求，结果培养7d后，适合这一温度条件的杂菌大量发生，导致发菌失败。针对这一问题作了技术调整，实施优势法接种培养，强调接种后的7～10d，必须把室温控制至25～28℃（菌丝定植后允许低一些），结果经此调整，制棒成功率高达98%以上。
　　安阳点2008-2009年冬春生产夏香菇150万棒，实施优势法在棚内打穴开放式接种，结果制棒成功率偏低，仅83%。经调查，导致这一结果的原因有二：一是料棒常压灭菌，100℃保持8h，灭菌不彻底，对未接种的料棒培养观察，20d后部分料棒有杂菌发生；二是部分菌种不纯，掰开检查部分菌种有绿色杂菌点块。这表明在实施优势法的四个必须条件中，有两个未能达到要求。在生产过程中还做了用接种帐，熏蒸消毒后接种，与应用优势法开放式接种相比，制棒成功率基本无差别。接种人员评价认为，实施优势法开放式接种是成功的，它给接种操作人员一个舒适的接种环境，不再接触化学药物，提高了接种效率，并有助于保证接种质量。
　　荥阳点2010-2011年两年生产夏香菇25万棒，全部实施优势法在棚内打穴开放式接种，结果制棒成功率达96%以上，掌握得好的制棒棚，制棒成功率高达100%。
　　登封点2011年秋栽香菇作优势法应用示范，2000多棒在棚内打穴开放式接种，结果全部发菌成功。菇农看后评价认为，这个办法好，可放心大胆的从事香菇生产，消除了因频繁接触化学药物对人身健康损害。
　　实施微生物优势培养法虽为开放式接种，但也要尽量减少接种环境的杂菌基数。为此，对无碍人身健康的一些作法仍应加以保留，如保持室（棚）内外清洁，酒清灯对接种工具灼烧灭菌、清水喷雾降尘、戴工作帽及穿工作服等。
　　参考文献
　　[1] M.B.斐多罗夫（张天伏等译）.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，1957：65-69，153-156.
　　[2] 杨新美.食用菌研究法[M].北京：中国农业出版社，1998：263-264.
　　[3] 罗信昌.食用菌病虫杂菌及防治[M].北京：农业出版社，1992：16.
　　[4] 李长喜.香菇代料开放式两步法栽培技术研究[J].中国食用菌，1999（1）：14-15.